ABL SH3-T79Y突變體聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的影響

文良雪，劉鑫，李會，黃寧姝，黃崢蘭，馮文莉

ABL SH3-T79Y突變體聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的影響

文良雪，劉鑫，李會，黃寧姝，黃崢蘭，馮文莉

目的分析慢性粒細(xì)胞白血病(CML) BCR-ABL蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域突變體(ABL SH3-T79Y)聯(lián)合伊馬替尼(IM)在體內(nèi)外對CML細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其發(fā)揮作用的機制。方法構(gòu)建重組腺病毒載體SH3-T79Y突變體，將其聯(lián)合IM處理K562/G01細(xì)胞后，采用克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，分析K562/ G01細(xì)胞體外增殖能力的變化。SH3-T79Y聯(lián)合IM處理KCL22細(xì)胞，構(gòu)建BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型，計算皮下瘤形成率，摘取瘤體進(jìn)行病理學(xué)檢查，分析KCL22細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的變化。SH3-T79Y聯(lián)合IM處理K562/G01細(xì)胞后，采用Western blotting檢測p-BCR-ABL、BCR-ABL、p-CrkL、CrkL、Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，分析聯(lián)合作用影響CML細(xì)胞增殖的機制。實驗中以PBS、腺病毒空載體及IM單獨處理細(xì)胞作為對照。結(jié)果相較于三個對照組，SH3-T79Y聯(lián)合IM處理K562/G01細(xì)胞后，細(xì)胞克隆形成率(28.74%±6.64%)明顯降低(P＜0.05)，細(xì)胞周期阻滯于S期。聯(lián)合處理KCL22細(xì)胞后，KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型成瘤率為16.7%，明顯低于IM單獨處理組(33.3%)和PBS對照組(100%)，瘤體病理學(xué)檢查見大量增殖的瘤細(xì)胞；Western blotting檢測結(jié)果顯示聯(lián)合處理后K562/G01細(xì)胞p-BCR-ABL、p-CrkL、BCRABL、CrkL及Cyclin D1的表達(dá)均降低。結(jié)論SH3-T79Y聯(lián)合IM通過抑制BCR-ABL、CrkL磷酸化和降低Cyclin D1表達(dá)，在體內(nèi)、體外發(fā)揮了抑制CML細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

細(xì)胞增殖；白血病，髓系，慢性，BCR-ABL陽性；RIN1蛋白；K562/G01細(xì)胞；KCL22細(xì)胞

RIN1是Ras蛋白的效應(yīng)因子[1-3]。RIN1基因定位于11號染色體長臂1區(qū)3帶2亞帶(11q13.2)。在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)細(xì)胞中，RIN1蛋白通過其富含的脯氨酸序列與CML 的BCR-ABL SH3、SH2區(qū)域相互作用，直接激活A(yù)BL酪氨酸激酶活性，促進(jìn)ABL下游Crk和CrkL磷酸化，正向調(diào)節(jié)ABL介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重組，因此RIN1 是ABL的結(jié)合伴侶；激活的ABL引起RIN1 Tyr36磷酸化，兩者協(xié)同調(diào)控細(xì)胞黏附和遷移，所以RIN1又是ABL的磷酸化底物[4-6]。因此，尋找一種ABL SH3突變體片段，提高其與RIN1蛋白的結(jié)合能力，通過兩者相互作用阻滯CML細(xì)胞BCR-ABL與RIN1的結(jié)合，降低BCR-ABL的酪氨酸激酶活性，可能是一種輔助治療CML的潛在方案。本課題組前期通過計算機藥物設(shè)計技術(shù)獲得ABL SH3突變體SH3-T79Y，相對于野生型SH3，該突變體與RIN1的結(jié)合能力大幅提高，同時成功構(gòu)建了重組腺病毒載體，通過免疫共沉淀驗證了SH3-T79Y與RIN1蛋白結(jié)合，與計算機模擬結(jié)果一致[7]。本研究以CML耐藥細(xì)胞株K562/G01和KCL22作為研究對象，探討SH3-T79Y聯(lián)合伊馬替尼(imatinib，IM)對BCR-ABL、CrkL磷酸化和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響，及其在體內(nèi)、外抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，旨在為CML尤其是耐IM的CML尋找新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、重組腺病毒載體與實驗動物 慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562/G01、KCL22為本室留存。重組腺病毒載體SH3-T79Y突變體(簡稱M3)與腺病毒空載對照(pAd-Track-CMV-null-Easy-1，簡稱T )為本課題組前期構(gòu)建[5]。SPF級Balb/c裸鼠18只，體重17.4～18.0g，3～4周齡，雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2009-0015]。

1. 2 主要試劑與儀器設(shè)備 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，IM(瑞士Novartis公司)，甲基纖維素(美國Sigma公司)，5×SDS-PAGE上樣緩沖液、封閉蛋白干粉(武漢博士德生物公司)，預(yù)染蛋白Marker(美國Themo Scientific公司)，PVDF膜、ECL發(fā)光液(美國Millipore公司)，p-c-ABL、p-CrkL、p-Stat5雞尾酒聯(lián)合抗體，BCR抗體(美國Cell Signaling公司)，CrkL多克隆抗體、Cyclin D1多克隆抗體、β-actin多克隆抗體(美國Bioworld公司)，HRP耦聯(lián)的羊抗兔IgG二抗(美國Santa Cruz公司)。CO2培養(yǎng)箱(Heraeus Heracell-240型，德國Heraeu公司)，超凈工作臺(美國Thermo公司)。

1.3 M3聯(lián)合IM在體外對K562/G01細(xì)胞增殖的影響

1.3.1 K562/G01細(xì)胞處理與分組 低代次K562/ G01在37℃、5%CO2條件下于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照1×106個/孔鋪6孔板，以1:1000體積比加入聚凝胺(ploybrene)與培養(yǎng)基，先加入重組腺病毒處理48h，再加入3μmol/L IM共同作用24h。實驗分4組，M3+IM組為干預(yù)組，T+IM組或T組、IM組和PBS組為對照組。處理方式：M3+IM組：以1:1000體積比加入聚凝胺與培養(yǎng)基，先加入重組腺病毒M3處理48h，再加入IM(終濃度3μmol/L)共同作用24h。T+IM組或T組：在K562/G01細(xì)胞中以1:1000體積比加入聚凝胺與培養(yǎng)基，先加入腺病毒空載對照T處理48h，再加入IM(終濃度3μmol/L)共同作用24h。T+IM組或T組：在K562/G01細(xì)胞中以1:1000體積比加入聚凝胺與培養(yǎng)基，先加入腺病毒空載對照T處理48h，再加入IM(終濃度3μmol/L)共同作用24h；T組不加入IM，其余同T+IM組(T+IM組作為IM組的對照，以證實空載病毒T對細(xì)胞有無影響；T組作為PBS組的對照，以證實空載病毒T對細(xì)胞有無影響)。IM組：在K562/G01細(xì)胞中加入IM(終濃度為3μmol/L)作用24h。PBS組：正常培養(yǎng)的K562/ G01細(xì)胞加入無菌PBS處理72h。

1.3.2 克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖 收集各組K562/G01細(xì)胞，無菌PBS洗滌2次去除病毒和IM。細(xì)胞計數(shù)后按500個/孔培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)液(含0.9% 甲基纖維素，20%胎牛血清)。每孔設(shè)置3個平行孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)10～14d后計數(shù)克隆數(shù)。1個克隆集落標(biāo)準(zhǔn)定義為其中細(xì)胞數(shù)目大于50個，將PBS對照組克隆形成率作為100%。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集各組K562/ G01細(xì)胞，1500r/min離心10min收集沉淀，經(jīng)預(yù)冷PBS以1500r/min離心5min洗滌2次。加入1ml預(yù)冷70%乙醇，轉(zhuǎn)入Epp管，4℃固定過夜。離心棄上清，PBS洗滌去除乙醇，加入50mg/L PI染色(含50mg/L RNAse)室溫避光孵育30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期。

1.4 M3聯(lián)合IM在體內(nèi)對KCL22細(xì)胞增殖的影響

1.4.1 KCL22細(xì)胞處理與BALB/c裸鼠飼養(yǎng) 低代次KCL22細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。移植前取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無菌PBS調(diào)整細(xì)胞濃度。BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(渝)2012-0001]層流架獨立通風(fēng)盒(individually ventilated cages，IVC)實驗室，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，常規(guī)飲水、墊料。遵循實驗動物使用的“替代、減少、優(yōu)化”(3R)原則給予人道關(guān)懷。

1.4.2 BALB/c裸鼠KCL22細(xì)胞移植 將18只BALB/c裸鼠隨機分為對照組、IM組、M3+IM組，每組6只。在超凈工作臺內(nèi)，將KCL22細(xì)胞按每只2×107個/200μl接種于BALB/c裸鼠左后肢腋部皮下。對照組：注射無菌PBS處理的KCL22細(xì)胞。IM組：KCL22細(xì)胞經(jīng)3μmol/L IM處理24h，注射接種；M3+IM組：M3處理KCL22細(xì)胞48h，再聯(lián)合3μmol/L IM共同處理24h，注射接種。

1.4.3 KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型一般情況觀察 移植后每日觀察動物一般狀態(tài)，包括荷瘤裸鼠體重、活動力、飲食、大小便和精神狀態(tài)以及皮下瘤體形成狀況。

1.4.4 M3聯(lián)合IM對KCL22細(xì)胞在BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型中致瘤能力的影響 觀察各組小鼠是否生成皮下實體腫瘤、測量瘤體大小。成瘤率=成瘤小鼠數(shù)量/該組小鼠總數(shù)×100%

1.4.5 KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型組織病理學(xué)檢查 待皮下瘤形成后，以頸椎脫臼法處死小鼠，分別摘取其移植瘤體，以及肝、脾和病變組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察瘤體組織彌散程度、壞死區(qū)及周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.5 Western blotting檢測M3+IM作用于K562/G01細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá) 取K562/G01細(xì)胞，分組及處理同1.3.1。提取細(xì)胞總蛋白，取80μg上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉，4℃封閉6h；分別加入p-c-ABL、BCR、p-CrkL、CrkL、Cyclin D1、β-actin(上述抗體均為1:1000稀釋，β-actin為內(nèi)參)一抗4℃孵育過夜；TBS-T室溫洗3次，每次5min；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1:1000)，室溫孵育1h；洗膜，ECL顯色，BioRad凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，計量資料以表示。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)、方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 M3聯(lián)合IM對K562/G01細(xì)胞克隆形成率的影響 克隆培養(yǎng)10d后成像結(jié)果顯示，與對照組(100%)比較，M3+IM組細(xì)胞克隆形態(tài)較小，克隆數(shù)量明顯減少(圖1)?？寺∨囵B(yǎng)14d后計數(shù)，將PBS 組K562/G01細(xì)胞克隆形成率計為100%，M3+IM組克隆形成率為28.74%±6.64%，明顯低于IM組(68.78%±11.0%，P＜0.05)，而IM組與T+IM組(65.01%±6.80%)的克隆形成率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2.2 M3聯(lián)合IM對K562/G01細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖2和表1。T組、IM組、PBS處理組K562/G01細(xì)胞S期細(xì)胞比例分別為54.18%、51.06%、50.79%，三者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，M3+IM組S期細(xì)胞比例為64.88%，明顯高于其他3組(P＜0.05)，而G2期細(xì)胞比例為0.00%，表明K562/ G01細(xì)胞經(jīng)過M3+IM處理后，周期明顯阻滯在S期。

圖1 K562/G01細(xì)胞克隆形成實驗Fig. 1 Clone formation assay of K562/G01 cellsLeft. Colony units of K562/G01 cells under inverted microscope (×100); A. M3+IM group; B. T+IM group; C. IM group; D. PBS group; Right. Clone formation rate of K562/G01 cells; (1)P＜0.05 compared IM and T+IM group

2.3 KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型成瘤情況小鼠接種KCL22細(xì)胞后局部皮膚無炎癥改變，皮丘于接種第2日消平。腫瘤生長至肉眼可見的潛伏期為4～10d。皮下瘤為圓球形或橢球形實體瘤，質(zhì)硬，表面光滑，顏色紅潤。各組皮下瘤形成率見表2。實驗中未觀察到腫瘤自然縮小或消退者。荷瘤鼠晚期體重下降，消瘦明顯，活動力及反應(yīng)力均低下，最終死亡，部分伴有嚴(yán)重的腹水、脊柱變形(圖3)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測M3+IM對K562/G01細(xì)胞周期的影響Fig. 2 Effects of M3+IM on Cell cycles of K562/01 cells determined by flow cytometry

表1 M3+IM對K562/G01細(xì)胞周期的影響(%)Tab. 1 Effect of M3+IM on cell cycles of K562/G01 cells(%)

表2 M3+IM對KCL22細(xì)胞皮下瘤形成率的影響Tab. 2 Effects of M3+IM on the formation rate of subcutaneous tumor of KCL22 cells

2.4 KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型病理檢查結(jié)果 解剖見皮下瘤與周圍組織邊界清晰，無浸潤生長現(xiàn)象，瘤體表層無包膜，切面粉紅色。HE染色和瑞氏染色均可見大量增殖的瘤細(xì)胞，形態(tài)較一致，細(xì)胞核深染，呈圓形、橢圓形或桿狀，胞質(zhì)少(圖4)。解剖未發(fā)現(xiàn)其他組織器官有腫瘤轉(zhuǎn)移，但可見部分荷瘤鼠肝臟有出血、萎縮或長有白色結(jié)節(jié)，脾臟亦萎縮。HE染色證實臟器有炎癥細(xì)胞浸潤、組織壞死。

2.5 M3聯(lián)合IM作用于K562/G01細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá) 由圖5可見，與PBS組、T+IM組、IM組比較，M3+IM可明顯抑制BCR-ABL、CrkL磷酸化水平，降低BCR-ABL、CrkL的總蛋白表達(dá)，同時減少Cyclin D1蛋白表達(dá)，使細(xì)胞增殖阻滯。

圖3 KCL11-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型成瘤情況Fig. 3 KCL22-BALB/c mice with subcutaneous tumorA. Subcutaneous tumor, B. Deformity of spinal column, C. Ascites

圖4 KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型病理檢查Fig. 4 Pathological examination of subcutaneous tumor in KCL22-BALB/c miceA. Wright's staining (×1000); B. HE staining (×400)

3 討 論

本實驗首先選用CML細(xì)胞株K562/G01作為研究對象，探討重組腺病毒載體SH3-T79Y突變體(簡稱M3)與IM聯(lián)用在體外抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)。該細(xì)胞株是天津血液病研究所以人源性BCR-ABL陽性的K562細(xì)胞為親代細(xì)胞，通過IM劑量遞增的方法誘導(dǎo)獲得，中度表達(dá)RIN1蛋白[8]。細(xì)胞最重要的生物學(xué)特征之一是細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖包括DNA復(fù)制，蛋白質(zhì)和糖、脂類合成，細(xì)胞分裂等行為，體現(xiàn)于細(xì)胞周期中[9]?？寺⌒纬蓪嶒灴啥糠治黾?xì)胞獨立生存能力，了解單個細(xì)胞增殖潛能。因此本研究利用克隆形成實驗并檢測細(xì)胞周期觀察細(xì)胞增殖效應(yīng)。結(jié)果表明，M3與IM聯(lián)合處理K562/G01細(xì)胞后，其克隆形成能力明顯下降，細(xì)胞周期阻滯于S期，證實M3與IM聯(lián)用能在體外有效抑制CML耐藥細(xì)胞株K562/G01的增殖。

圖5 Western blotting檢測M3+IM作用于K562/G01細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Western blotting determination of expression of related proteins in K562/G01 cells treated by M3+IM

KCL22細(xì)胞是人源髓系急變CML細(xì)胞株，BCR-ABL陽性，雙Ph染色體，體外培養(yǎng)半貼壁生長，特征基本上與K562細(xì)胞相似，但其為IM中度耐藥株，高表達(dá)RIN1蛋白[10-11]。由于BALB/c裸鼠第11對染色體隱性基因發(fā)生突變，所以遺傳性無胸腺，無毛，缺乏成熟T細(xì)胞，但B細(xì)胞和NK細(xì)胞功能基本正常，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等研究。因此，本實驗構(gòu)建KCL22-BALB/c裸鼠皮下實體瘤模型，探討M3聯(lián)合IM處理對KCL22細(xì)胞裸鼠致瘤能力的影響。結(jié)果表明，PBS處理對照組成瘤率為100%，瘤體大小不一致，最大可達(dá)7mm×10mm，最小3mm×4mm；瑞氏染色和HE染色可見瘤細(xì)胞彌漫分布，形態(tài)特征與體外培養(yǎng)的KCL22細(xì)胞一致；肝臟和脾臟組織病理學(xué)檢測可見炎癥細(xì)胞浸潤和組織壞死，同時小鼠伴有大量腹水生成，肝硬化，最終死亡，表明KCL22細(xì)胞適應(yīng)于裸鼠皮下的生長環(huán)境，所形成的實體瘤能在動物體內(nèi)持續(xù)增殖，并保持原細(xì)胞的形態(tài)特征。M3+IM組成瘤率為16.7%，瘤體生長速度較慢，瘤塊體積較小，至實驗結(jié)束動物均未死亡，且各項指標(biāo)均優(yōu)于IM組，說明M3聯(lián)合IM處理KCL22細(xì)胞后可明顯抑制皮下實體瘤的形成，且效果優(yōu)于單獨使用IM。本研究證實聯(lián)合處理可有效抑制CML細(xì)胞株KCL22在小鼠體內(nèi)的生長和增殖能力。

為了初步探討突變體M3與IM聯(lián)用抑制CML細(xì)胞增殖的作用機制，本研究采用Western blotting檢測了BCR-ABL及其重要底物CrkL磷酸化和總蛋白水平的變化，并分析細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)。BCR-ABL蛋白是CML的特征性融合蛋白[12-14]，具有強烈的酪氨酸激酶活性，可導(dǎo)致自身第177位酪氨酸殘基磷酸化，為接頭蛋白CrkL等提供連接位點[15]，進(jìn)而調(diào)節(jié)Jak2/Stat5、PI3K/Akt、MEK/Erk等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，傳遞細(xì)胞增殖、凋亡的異常信號[16]。本研究結(jié)果顯示，M3聯(lián)合IM可明顯抑制BCR-ABL和底物CrkL磷酸化水平，使BCR-ABL、CrkL總蛋白表達(dá)水平降低，并減少Cyclin D1的表達(dá)。以上結(jié)果表明，M3聯(lián)合IM抑制K562/G01細(xì)胞增殖的作用機制與其調(diào)節(jié)BCR-ABL相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，本實驗證實ABL SH3-T79Y突變體與IM聯(lián)合作用在體內(nèi)外均具有抑制耐IMCML細(xì)胞株增殖的作用，表明將阻滯RIN1蛋白與BCR-ABL結(jié)合的策略用于CML治療具有可行性，為臨床解決CML患者IM耐藥提供了實驗基礎(chǔ)。

[1]Wang Y, Waldron TR, Dhaka A,et al. The Ras effector RIN1 derectly competes with RAF and is regulated by 14-3-3 proteins[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(3): 916-926.

[2]Chen YH, Lan ZP, Hui QY,et al. Expression and significance of RASSF1A and p53 protein in gastric mucosal lesions[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 664-665. [陳雅慧, 蘭忠平, 惠起源, 等. RASSF1A及p53蛋白在胃黏膜病變中的表達(dá)及意義[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(6): 664-665.]

[3]Huang HW, Li YX. Expression and clinical significance of EGFR and K-ras in colorectal cancer[J]. J Logist Univ PAPF (Med Sci), 2013, 22(5): 345-347, 359, 461. [黃鴻武, 李永翔. EGFR和K-ras在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013, 22(5): 345-347, 359, 461.]

[4]Bliss JM, Venkatesh B, ColicelliJ. The RIN family of Ras effectors[J]. Methods Enzymol, 2006, 407: 335-344.

[5]Hu H, Bliss JM, Wang Y,et al. RIN1 is an ABL tyrosine kinase activator and a regulator of epithelial-cell adhesion and migration[J]. Curr Biol, 2005, 15(9): 815-823.

[6]Cao X, Tanis KQ, Koleske AJ,et al. Enhancemnt of ABL kinase catalytic efficiency by a direct binding regulator is independent of other regulatory mechanisms[J]. J Biol Chem, 2008, 283(46): 31401-31407.

[7]Liu X. Inhibition of activity of BCR-ABL by competitive binding on RIN1 and enhancement of the sensitivity of Imatinib[D]. Chongqing: Chongqing Medical University, 2014. [劉鑫. 高親合力ABL SH3片段競爭性結(jié)合RIN1抑制BCR-ABL活性和增加伊馬替尼敏感性的研究[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2014.]

[8]Qi J, Peng H, Gu ZL,et al. Establishement of an imatinib resistant cell line K562/G01 and its characterization[J]. Chin J Hematol, 2004, 25(6): 337-341. [齊靜, 彭暉, 顧振綸, 等. 伊馬替尼耐藥的K562 細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2004, 25(6): 337-341.]

[9]Younos IH, Dafferner AJ, Gulen D,et al. Tumor regulation of myeloid-derived suppressor cell proliferation and trafficking [J]. Int Immunopharmacol, 2012, 13(3): 245-256.

[10] Chmine K, Nagai T, Tarumoto T,et al. Analysis of gene expression profiles in an imatinib-resistant cell line, KCL22/ SR[J]. Stem Cells, 2003, 21(3): 315-321.

[11] Thai M, Ting PY, McLaughlin J,et al. ABL fusion oncogene transformation and inhibitor sensitivity are mediated by the cellular regulator RIN1[J]. Leukemia, 2011, 25(2): 290-300.

[12] Tala I, Chen R, Hu T,et al. Contributions of the RhoGEF activity of p210 BCR/ABL to disease progression[J]. Leukemia, 2013, 27(5): 1080-1089.

[13] Shi XP, Chen X, Tan Y,et al. Effects of Garcinia acid by downregulation of Bcr-Abl protein on the proliferation and apoptosis of chronic myelogenous leukemia cell line K562[J]. J Shandong Univ (Health Sci), 2013, 51(7): 10-14. [師憲平, 陳鑫, 譚茵, 等. 藤黃酸下調(diào)Bcr-Abl蛋白對慢粒細(xì)胞株K562增殖和凋亡的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013, 51(7): 10-14.]

[14] Xiao H, Wang HX, Tao K,et al. Location of CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptide in K562 cells and its interaction with BCR-ABL protein[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(11): 896-899. [肖恒, 王海霞, 陶崑, 等. CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在K562細(xì)胞中的定位及其與BCR-ABL蛋白的相互作用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(11): 896-899.]

[15] Patel H, Marley SB, Gordon MY. Detection in primary chronic myeloid leukaemia cells of p210BCR-ABL1 in complexes with adaptor proteins CBL, CRKL, and GRB2[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2006, 45(12): 1121-1129.

[16] Cilloni D, Saglio G. Molecular pathways: BCR-ABL[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(4): 930-937.

Effects of ABL SH3-T79Y mutant combined with imatinib on the proliferation of chronic myeloid leukemia cells

WEN Liang-xue, LIU Xin, LI Hui, HUANG Ning-shu, HUANG Zheng-lan, FENG Wen-li*
College of Laboratory Medicine, Key Laboratory of Medical Diagnostics, Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: fengwlcqmu@sina.com

, E-mail: fengwlcqmu@sina.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30871102)

ObjectiveTo analyze the influence of SH3 domain mutant (ABL SH3-T79Y) in BCR-ABL protein of chronic myeloid leukemia (CML) in combination with imatinib (IM) on the proliferation of CML cellsin vivoandvitro, and to discuss the mechanism thereof.MethodsRecombinant ABL SH3-T79Y mutant adenovirus vectors which were successfully constructed in previous work was used with IM to treat K562/G01 cells, then the cell-colony forming ability of K562/G01 cells was determined by clone formation assay, and cell cycle was assessed by flow cytometry. KCL22 cells were treated by recombinant SH3-T79Y and IM to construct subcutaneous solid tumor model in Balb/c nude mice, then the formation rate of subcutaneous tumor was estimated, the pathological examination was conducted, and the proliferation ability of KCL22 cells was assayed. K562/G01 cells were treated by SH3-T79Y and IM in combination, and the expression levels of p-BCR-ABL, BCR-ABL, p-CrkL, CrkL and Cyclin-D1 protein were determined by Western blotting. Cells treated with PBS, null recombinant adenovirus vectors or IM alone served as control groups.ResultsCompared to the 3 control groups, clone forming rate of K562/G01 cells decreased significantly (P<0.05) and cell cycles were arrested at S phase after being combined SH3-T79Y and IM treatment. The subcutaneous solid tumor formation rate in KCL22-Balb/c nude mice was 16.7% after combined SH3-T79Y and IM treatment, and large number of tumor cells were observed in tumor pathology examination. Western blotting revealed that the expression levels of p-BCR-ABL, p-CrkL, BCR-ABL, CrkL and Cyclin-D1were decreased in K562/G01 cells.ConclusionCombined treatment of SH3-T79Y and imatinib may inhibit the proliferation of CML cellsin vivoandin vitroby decreasing BCR-ABL and CrkL phosphorylation as well as Cyclin-D1 protein.

cell proliferation; leukemia, myelogenous, chronic, BCR-ABL positive; RIN1proteins; K562/G01cells; KCL22 cells

R733.72

A

0577-7402(2015)08-0616-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.03

2015-01-14；

2014-06-29)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

國家自然科學(xué)基金(30871102)

文良雪，碩士研究生。主要從事白血病的分子機制與基因治療方面的研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室(文良雪、劉鑫、李會、黃寧姝、黃崢蘭、馮文莉)

馮文莉，E-mail：fengwlcqmu@sina.com