新型大鼠下腔靜脈血栓模型的建立及血栓溶解演變過程研究

付健，唐博，陳以寬，孫建明，羅文軍

新型大鼠下腔靜脈血栓模型的建立及血栓溶解演變過程研究

付健，唐博，陳以寬，孫建明，羅文軍

目的探討一種新的大鼠下腔靜脈血栓模型建立方法，并動態(tài)研究靜脈血栓溶解的自然演變過程和相關機制。方法SD大鼠48只隨機分為實驗組和對照組。實驗組縮窄下腔靜脈管腔面積80%～90%，然后隨機分為3組(n=12)：A組結扎左腎靜脈以下下腔靜脈所有屬支并以神經生物夾刺激靜脈壁誘導血管內皮損傷；B組聯合神經生物鉗損傷下腔靜脈壁；C組聯合結扎下腔靜脈所有屬支。對照組(D組，n=12)為假手術組，僅游離而不縮窄下腔靜脈。術后比較各組靜脈血栓的長度、重量和管腔面積百分比，確定下腔靜脈血栓動物模型的最佳建模方式。另取大鼠30只，按最佳方式建模，術后行下腔靜脈造影及血栓HE和Masson染色、ED-1免疫組化染色，動態(tài)分析靜脈血栓溶解的自然演變過程及參與此過程的細胞類型。結果大體觀察結果顯示A、B、C組均成功誘導血栓形成，A組血栓長度及重量明顯高于B、C組(P<0.01)，而B、C組間比較無明顯差異(P>0.05)，D組無血栓形成。A組靜脈血栓占下腔靜脈管腔面積明顯大于B、C組(P<0.01)，確定A組為最佳動物模型組。最佳模型組血栓HE和Masson染色結果顯示，隨時間推移，血栓溶解過程中新生毛細血管逐漸增多，膠原纖維及細胞外基質成分含量逐漸增加；ED-1染色結果顯示血栓溶解過程伴有大量巨噬細胞浸潤；靜脈造影結果表明下腔靜脈血栓自然溶解完全再通需3～4周。結論采用縮窄下腔靜脈管腔聯合結扎靜脈屬支并損傷血管壁法誘導形成的大鼠下腔靜脈血栓與人類深靜脈血栓近似，可作為建立深靜脈血栓動物模型的首選方法。大鼠下腔靜脈血栓的自然溶解演變過程伴隨血管新生，而巨噬細胞在此過程中具有重要作用。

靜脈血栓形成；疾病模型，動物；病理過程

靜脈血栓栓塞性疾病在世界范圍內均有較高的發(fā)病率及死亡率，每年約90萬人發(fā)生靜脈血栓栓塞，死亡率高達25%～30%[1-2]。目前國內尚缺乏靜脈血栓準確的流行病學資料，而隨著診斷意識和檢查技術的提高，臨床報道的病例數明顯增加，但臨床治療效果尚不盡如人意[3-4]。為改變這一現狀，勢必需要分析靜脈血栓的自然溶解過程及相關機制，從而指導臨床探索加速靜脈血栓溶解再通的有效途徑。既往報道建立靜脈血栓動物模型的方法有多種，但均存在一定限制和缺點[5]，本研究對已報道的建模方式加以改進，試圖建立一種新型、高效、穩(wěn)定的靜脈血栓動物模型，使其能更好地模擬人體深靜脈血栓形成的病理生理過程，為進一步的實驗研究及藥物治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康成年SD大鼠48只，雄性，體重327.4±41.7g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供；顯微外科器械由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院外科實驗室提供；26G注射器針頭購自BD公司；Masson染色試劑盒和二抗生物素標記羊抗鼠IgG試劑盒購自福州邁新公司；兔抗大鼠ED-1單克隆抗體購自Santa Cruz公司；造影劑碘普羅胺購自Bayer公司。

1.2 方法

1.2.1 造模 將48只大鼠隨機分為實驗組(n=36)和對照組(n=12)，實驗組再隨機分為A、B、C組(各12 只)，對照組為D組。實驗組參照Brill等[6]的方法加以改進建立下腔靜脈血栓模型。大鼠經10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，正中切口進腹，游離下腔靜脈并順血管壁放置26G針頭，以4-0絲線于左腎靜脈下方同時結扎下腔靜脈和針頭，小心拔出針頭，使下腔靜脈縮窄80%～90%。此基礎上，A組結扎左腎靜脈以下下腔靜脈所有屬支并以神經生物夾刺激靜脈壁誘導血管內皮損傷；B組聯合神經血管鉗阻斷下腔靜脈60s，松開30s，不同部位各重復2次以損傷下腔靜脈壁；C組聯合結扎下腔靜脈所有屬支。D組同法游離下腔靜脈并在左腎靜脈下方穿過4-0絲線，縫線打空心結不縮窄下腔靜脈，不結扎靜脈屬支。所有動物術后自由飲水，正常飼養(yǎng)，不使用抗生素。

1.2.2 標本準備 動物處死后沿原腹部切口作梭形切口進腹，解剖左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，顯微剪完整分離下腔靜脈，切取左腎靜脈以下下腔靜脈及其內部的血栓，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、常規(guī)切片后行HE、Masson染色及ED-1免疫組化染色。

1.2.3 最佳建模方式的確定 各組造模后，分別于術后1、3、7d處死大鼠，按照上述方法制備血栓標本，根據大體標本分析及血栓面積占下腔靜脈管腔面積百分比確定最佳建模方式。

1.2.3.1 血栓大體標本分析 觀察下腔靜脈的顏色、張力，取材后測定離體血栓的長度及重量，行組間比較。

1.2.3.2 血栓面積占下腔靜脈管腔面積百分比的測定 血栓標本行HE染色，從結扎點依次向遠端間隔3mm連續(xù)切片5張，40倍視野下觀察并計算血栓面積占下腔靜脈管腔面積的百分比。

1.2.4 血栓溶解演變過程分析 另取SD大鼠30只，按前述篩選出的最佳方式建模，于1、3、7、14、21、28d取血栓標本進行分析。

1.2.4.1 血栓溶解率測算 常規(guī)HE染色，從結扎點依次向遠端間隔3mm連續(xù)切片5張，40倍視野下觀察并計算血栓溶解率。血栓溶解率=(管腔面積－血栓面積)/管腔面積×100%。分析血栓溶解率與時間的關系。

1.2.4.2 血栓機化率及毛細血管計數測算 Masson染色將膠原纖維、細胞外基質及血管壁染成藍色，細胞核呈黑色。采用醫(yī)學圖像分析系統，根據膠原纖維及細胞外基質染色區(qū)域占血栓面積百分比計算血栓機化率，同時在40倍光鏡視野下行毛細血管計數，分析新生血管情況。

1.2.4.3 ED-1免疫組化分析 血栓標本切片行ED-1免疫組化染色后，在400倍光鏡視野下分析參與血栓溶解的細胞類型，病理圖像分析系統測算血栓內陽性細胞率。

1.2.4.4 下腔靜脈造影分析 造模后解剖大鼠髂靜脈，1ml注射器穿刺并緩慢推注造影劑碘普羅胺，行數字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)并采集圖像，觀察大鼠下腔靜脈血栓的自然再通過程。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據結果以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動物存活情況及血栓大體觀察結果 48只大鼠中46只存活，C組術后1d死亡1只，探查見左側輸尿管及腎臟明顯積水，明確為手術誤操作結扎輸尿管所致，B組術后5d死亡1只，探查見腹腔內大量膿液，確定死亡原因為腹腔感染。A組及D組未見動物死亡。實驗組建模后均可見大鼠后肢及臀部腫脹，1d時最明顯，隨時間推移逐漸減輕，D組大鼠未見后肢及臀部腫脹。術后1d時A組大鼠下腔靜脈內充滿大量血栓，張力高，呈暗黑色，長度近下腔靜脈全長，部分血栓蔓延至雙側髂靜脈內，解剖時血栓與靜脈壁易分離，血栓完整性好、不易碎裂；B、C組血栓長度不一，均未累計下腔靜脈全長，髂靜脈內未見血栓，血栓剝離時穩(wěn)定性較A組差；D組下腔靜脈內未見血栓形成。術后3d及7d時實驗各組血栓長度均有所減少，但A組血栓長度仍高于其他各組(圖1)，各組血栓剝離較困難且頭端呈淡紅色及灰白色，A組血栓質地較韌，而B、C組血栓易碎裂。術后1、3、7d時A組血栓重量均高于B、C兩組，差異有統計學意義，而B、C組間比較差異無統計學意義(表1)。

2.2 血栓面積占血管面積的百分比 血栓標本HE染色結果顯示，術后1d時A、B、C組血栓面積占下腔靜脈管腔面積的百分比分別為95.5%±0.9%、93.6%±1.2%、92.5%±1.1%，3組間比較差異無統計學意義。術后3d及7d時A組血栓面積占下腔靜脈管腔面積的百分比分別為85.2%±3.8%、54.6%±4.6%，均明顯高于B組(61.6%±4.7%、40.6%±3.1%)及C組(57.8%±3.3%、36.2%±2.9%)，差異均有統計學意義(P<0.01)，而B、C兩組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。D組無血栓形成。2.3 最佳模型組大鼠存活情況及大體觀察 根據上述結果，確定A組為最佳模型組。選取30只SD大鼠按照A組方法建模，術后14d死亡1只，探查見腸管明顯擴張伴壞死，腹腔內暗紅色炎性滲液，確定死亡原因為腸梗阻。大鼠總體存活率為96.7%。大體觀察：術后1d至7d結果同前，術后14d至21d大鼠后肢及臀部腫脹明顯緩解，28d完全消失。

圖1 A組下腔靜脈血栓大體觀察Fig. 1 Gross observation of the inferior vena cava thrombus in group AA. 1day after modeling; B. 3 days after modeling; C. 7 days after modeling

表1 各組下腔靜脈血栓長度與重量比較(±s，n=12)Tab. 1 Comparison of the inferior vena cava thrombus length and weight of each group (±s,n=12)

表1 各組下腔靜脈血栓長度與重量比較(±s，n=12)Tab. 1 Comparison of the inferior vena cava thrombus length and weight of each group (±s,n=12)

(1)P<0.01 compared with group A

Group Length (mm) Weight (mg) 1d 3d 7d 1d 3d 7d A 17.7±3.1(1) 15.1±1.4(1) 8.7±1.1(1) 31.8±3.6(1) 25.4±1.7(1) 14.8±1.3(1)C 18.3±2.8(1) 15.5±1.9(1) 9.3±1.3(1) 32.5±2.4(1) 26.1±2.9(1) 15.2±1.1(1)29.8±4.3 24.2±3.1 15.8±1.9 53.5±5.3 41.2±3.7 28.1±2.4 B

2.4 最佳模型組靜脈血栓HE染色 術后1d血栓充滿靜脈管腔，形態(tài)為層狀血栓(圖2A)，3d時血栓開始收縮，血栓與血管壁間出現裂隙(圖2B)，7d時血栓體內部、血栓與血管壁之間裂隙擴大，其中可見散在新生管腔樣結構形成(圖2C)，術后14d、21d血栓逐漸溶解，血栓體中央區(qū)域可見大量毛細血管，管腔內充滿紅細胞，血栓機化明顯(圖2D、E)，并于術后28d完全溶解、再通(圖2F)。術后1、3、7、14、21、28d時血栓溶解率分別為4.2%±1.1%、13.5%±2.3%、48.6%±5.4%、66.9%±3.1%、82.2%±3.8%、96.3%±2.1%。

2.5 最佳模型組靜脈血栓Masson染色結果 光鏡觀察可見，術后1d及3d時代表膠原纖維、細胞外基質及血管壁的藍色區(qū)域僅限于血栓邊緣，膠原纖維含量較低，新生血管少見，隨著時間推移，7d至14d后藍色區(qū)域擴大，逐漸累及血栓體大部(圖3)，21d時血栓機化明顯，大量新生血管形成，管腔再通明顯，而28d時血栓機化較前減少，血栓近乎完全溶解。術后1、3、7、14、21、28d時下腔靜脈血栓機化率分別為1.2%±0.1%、5.4%±1.3%、21.4%±4.9%、31.4%±5.9%、57.5%±12.8%、43.8%±7.8%，毛細血管計數結果分別為1.3±0.2、1.8±0.3、6.4±1.5、19.4±3.3、0.2±0.1、0。

圖2 最佳模型組下腔靜脈血栓HE染色結果(×40)Fig. 2 HE staining of the inferior vena cava thrombosis in the best model group (×40) A. Day 1; B. Day 3; C. Day 7; D. Day 14; E. Day 21; F. Day 28

圖3 最佳模型組術后7d下腔靜脈血栓Masson染色結果(×40)Fig. 3 Masson staining of the inferior vena cava thrombosis in the best model group at day 7 post-operation (×40)

2.6 最佳模型組ED-1免疫組化分析 ED-1免疫組化染色胞質呈棕黃色顆粒者判斷為陽性細胞，代表單核巨噬細胞系。建模后3d內陽性細胞多位于血栓體的邊緣、血栓體與血管壁間隙區(qū)域(圖4)，7d 至14d血栓體周圍陽性細胞明顯減少，而血栓體內部陽性細胞較前逐漸增多，21d陽性細胞數達峰值而后快速減少。術后1、3、7、14、21、28d時血栓內陽性細胞率分別為5.7%±0.8%、10.4%±1.2%、23.1%±2.9%、29.5%±2.7%、33.5%±1.7%、 16.3%±0.5%。

2.7 最佳模型組DSA造影結果 術后1d下腔靜脈無顯影，部分模型對側髂靜脈可顯影，說明下腔靜脈內全段血栓形成，造影劑經對側髂靜脈反流(圖5A)；術后3d下腔靜脈遠端顯影，提示血栓遠端部分溶解，近端仍閉塞(圖5B)；術后7d可見下腔靜脈顯影，管腔呈線樣征，造影劑流速加快，未見明顯側支循環(huán)，表明血栓部分再通(圖5C)；術后14d可見側支循環(huán)形成(圖5D)；術后21d管腔基本再通，但下腔靜脈近端造影劑變細，表明下腔靜脈近端血栓未完全溶解吸收(圖5E)；術后28d造影顯示下腔靜脈完全再通，造影劑回流通暢，周圍側支循環(huán)消失(圖5F)。

圖4 最佳模型組術后3d下腔靜脈血栓ED-1免疫組化染色結果(×400)Fig.4 ED-1 immunohistochemistry staining of the inferior vena cava thrombus in the best model group at day 3 postoperation (×400)T. Thrombus; VW. Vein wall

3 討 論

以往文獻報道建立靜脈血栓動物模型的方法包括單純下腔靜脈結扎[7]、彩超定位下腔靜脈縮窄[8]、凝血酶靜脈腔內注射[9]、止血藥物輸注損傷靜脈壁[10]等，這些方法僅通過一或兩種途徑誘導靜脈血栓，存在大鼠死亡率較高，血栓形成不穩(wěn)定，血栓形態(tài)與人體病理狀態(tài)形成的血栓差異大等缺點，同時這些方法與Virchow提出的靜脈血栓形成三大經典因素[5]不相符，未能準確模擬人體內血栓形成的層狀結構，相關文獻[7-10]也未對動物模型誘導的血栓進行定量分析和動態(tài)研究。

圖5 最佳模型組下腔靜脈DSA造影結果Fig. 5 Imaging of digital subtraction angiography of the inferior vena cava in the best model groupA. No contrast agent in the inferior vena cava at day 1; B. The distal of inferior vena cava developing at day 3; C. The all of inferior vena cava developing at day 7, but the inferior vena cava is stenosis; D. The formation of collateral circulation at day 14; E. The inferior vena cava is fully developed, but the proximal stenosis of the inferior vena cava at day 21; F. The inferior vena cava is fully developed at day 28

本研究依據Virchow理論中的血流淤滯、高凝狀態(tài)及血管內皮損傷三個血栓形成基本要素設計了實驗方案，通過縮窄下腔靜脈管徑及結扎屬支引起血流緩慢，血管夾鉗夾靜脈壁產生內皮損傷及手術創(chuàng)傷誘導高凝狀態(tài)來建立動物模型，并對比各獨立因素的相互作用。實驗結果顯示各組建模后1、3、7d下腔靜脈血栓誘導成功率均為100%，靜脈腔形成的血栓形態(tài)為層狀血栓，由灰白色血栓頭、暗紅色血栓體和鮮紅色血栓尾3部分組成，不同于其他文獻報道中動物模型的單純血凝塊結構[11]，這種層狀血栓結構更符合人體病理血栓形態(tài)結構[12]，說明本動物模型建立方式可以很好地模擬人體內血栓形成的自然過程。實驗組術后7d內總體生存率為94.4%，表明縮窄下腔靜脈管腔后，即使成功誘導血栓也不會發(fā)生致死性肺栓塞，對大鼠各生理系統影響極小。各實驗組組內比較，A組大鼠下腔靜脈血栓無論重量、長度還是血栓面積百分比均高于B、C組，表明聯合三種因素誘導的靜脈血栓較兩種因素誘導的血栓更加穩(wěn)定、廣泛，B、C兩組間血栓量結果比較差異無統計學意義，證實血管壁刺激和結扎各屬支這兩個獨立因素對誘導血栓形成作用無明顯差異。

我們體會建模過程中需注意以下細節(jié)：①合適器械的選擇和無菌操作是建模成功的關鍵，必須具備顯微器械等能進行精細操作的器械和無菌操作室；②充分解剖左腎靜脈與下腔靜脈匯合處，縮窄下腔靜脈程度以80%～90%最為合適，既能誘導血流緩慢又不會出現肺栓塞；③結扎雙側腰靜脈的同時，必須結扎下腔靜脈后壁的各屬支(腰靜脈和脊靜脈)，包括左腎以下下腔靜脈后壁2～3個屬支，結扎后壁屬支時應在縮窄下腔靜脈之前，否則會使靜脈壓力增高引起出血；④鉗夾靜脈壁以誘導內皮損傷次數以4次連續(xù)鉗夾比較合理，每次1min，間隔30s；⑤注意保護輸尿管，以免術后發(fā)生腎積水，C組因此出現動物死亡；⑥初次手術裸化左腎靜脈以下下腔靜脈壁必須充分，以便后續(xù)實驗取材方便；⑦術后適當給予保暖，可有效降低大鼠死亡率。

靜脈血栓溶解機化是個復雜的動態(tài)演進過程[13-14]。本研究觀察發(fā)現大鼠下腔靜脈血栓自然溶解過程為3～4周，較人類下肢深靜脈血栓溶解機化周期明顯縮短[15]。病理圖像分析提示術后1d下腔靜脈管腔完全阻塞，無明顯溶解現象，術后3d血栓長度和重量開始減少，同時血栓中央及血栓與靜脈壁內膜之間產生裂隙，說明此時血栓邊緣與血液接觸的部分被血液內纖溶酶溶解、吸收而收縮，致使血栓內部出現裂隙，但并未見到大量的新生毛細血管，術后7d開始血栓體內可見管腔樣結構形成，同時膠原纖維及細胞外基質成分在血栓與血管壁接觸部位出現最多，推測血栓機化過程是從病變部位血管壁與血栓相連的部分始發(fā)，由血栓周圍向血栓中央逐漸發(fā)展的，待14d及21d時血栓進一步溶解，機化范圍進一步擴散，新生血管內皮細胞進一步增殖，向裂隙遷移覆蓋，形成相互吻合再通的新生血管腔，這些血管腔隨血流動力學作用而改建形成小靜脈，使被阻塞的靜脈部分地重建血流，繼而發(fā)展到28d時血管腔完全融合貫通，最終實現血栓完全再通。對于深靜脈血栓機化和再通過程而言，新生毛細血管形成及內皮化過程扮演了重要角色[16]。本課題組前期研究也證實了這一過程[17]。

血栓的機化和再通是由多種細胞因子和細胞參與的動態(tài)的、協調的過程[18]。本研究結果顯示血栓的細胞組成初期以紅細胞為主，隨著溶解機化的演進，ED-1陽性的單核巨噬細胞系細胞數開始增多，并與血栓機化進程一致，單核巨噬細胞能通過自分泌和旁分泌基質金屬蛋白酶、遷移因子、趨化因子和促血管新生因子如VEGF、bFGF等誘導纖維母細胞的增長及新生內皮細胞的覆蓋，最終促使血栓完全機化再通，這與創(chuàng)傷愈合過程中肉芽組織的形成過程非常相似[5]。

綜上所述，本研究通過大體觀察、病理分析及靜脈造影檢查等多種方式證實構建的模型能夠準確模擬人體內深靜脈的層狀血栓結構，建模成功率高，死亡率低，可重復性強，血栓形成穩(wěn)定，可作為建立深靜脈血栓動物模型的首選方法。在此基礎上我們通過動態(tài)觀察大鼠下腔靜脈產生血栓到血栓自然完全溶解的全過程，發(fā)現其自然溶解演變過程伴隨血管新生機制，而巨噬細胞在此過程中具有重要作用，為后續(xù)深入研究靜脈血栓形成的病理生理過程中各因子的相互作用及信號傳導通路奠定了實驗基礎。

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Reproduction of a new inferior vena cava thrombosis model and study of the evolutionary process of thrombolysis in rats

FU Jian, TANG Bo*, CHEN Yi-kuan, SUN Jian-ming, LUO Wen-jun
Department of Vascular Surgery, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: nokiatb@126.com

, E-mail: nokiatb@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270398) and the Medical Science Development Foundation of Chongqing Health Bureau (2012-2-053)

ObjectiveTo investigate the reproduction of a new model of thrombosis of inferior vena cava (IVC), and explore the natural process of thrombolysis and its mechanism in rats.MethodsForty-eight SD rats were randomly classified into experimental group and control group. In the experimental group, the lumen of the vena cava was blocked by about 80%-90% with a ligature of IVC below the left renal vein, and then the animals were redivided into three subgroups (n=12, each). In group A, the IVC endothelium was damaged and its tributaries were ligated. In group B, the IVC endothelium was damaged and its tributaries were not ligated. In group C, no damage was done to the endothelium of the IVC but all its tributaries were ligated. A sham-operated group served as control. The length and weight of the vinous thrombus and the percentage of the IVC luminal area were compared after operation to determine the optimum animal model of venous thrombosis. According to the best mode to establish the model, the thrombus specimens were collected and detected by HE and Masson staining, and the ED-1 expressions were examined by immunohistochemical staining after thrombus formation in 30 rats. The natural evolution of intravenous thrombolysis was analyzed dynamically and the cell types involved in this process were observed.ResultsGross observation showed that the experimental group was successfully induced thrombus formation. The thrombus length and weight in group A was significantly higher than thatin group B and group C, and no difference between group B and C. The thrombus area in group A was significantly higher than that in groups B and group C, which identified the group A was the optimal model group of venous thrombosis. In the group reproduced by the best mode of the model, HE and Masson staining results showed that new capillaries and the components of collagen and extracellular matrix increased gradually with the passage of time in the process of thrombus resolution. ED-1 staining indicated a massive infiltration with macrophages during the thrombus resolution. The results of inferior vena cavography showed that natural resolution of the IVC thrombus and complete revascularization needed 3 or 4 weeks.ConclusionsThe morphological changes in venous thrombus induced by narrow lumen combined with ligation and vessel injury of the IVC in rats are similar to those in human being, which could be a preferred method to establish animal model of deep venous thrombosis. The evolution of natural thrombus resolution comprises angiogenesis and the macrophages play an important role in this process.

venous thrombosis; disease models, animal; pathologic process

R364.15

A

0577-7402(2015)08-0610-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.02

2014-11-15；

2015-06-27)

(責任編輯：胡全兵)

國家自然科學基金(81270398)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目(2012-2-053)

付健，醫(yī)學碩士。主要從事周圍血管疾病的基礎與臨床研究

400010 重慶 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院血管外科(付健、唐博、陳以寬、孫建明、羅文軍)

唐博，E-mail：nokiatb@126.com