炎癥微環(huán)境作用下非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號通路對牙周膜干細胞成骨分化的影響*

劉 娜 李 華 張 洋 劉洪臣

牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織再生修復的重要種子細胞[1]。但大量研究結果表明在慢性牙周炎的侵襲作用下牙周組織再生修復能力明顯下降[2，3]，如何促進牙槽骨再生是目前牙周炎導致的牙周組織損傷修復研究的熱點。 干細胞參與組織再生受多種分子信號通路的調(diào)控，Wnt 通路在牙周膜干細胞成骨分化過程中發(fā)揮關鍵作用。Wnt 信號通路分為經(jīng)典及非經(jīng)典兩種形式。目前在干細胞參與成骨分化的過程中研究較多的為Wnt / β-catenin 經(jīng)典信號通路，非經(jīng)典Wnt / 鈣離子(Wnt / Ca2+)通路主要由Wnt5a 和Wnt11 激活，可能通過G 蛋白激活PLC(Phos pholi pase C)和PKC (Proteinkinase C)，從而引起細胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活，以調(diào)節(jié)細胞運動和細胞粘著性。此外，Wnt/ Ca2+信號通路可以激活CaMKII 進而活化轉錄生長因子β 活化激酶1(TAK-1)-NLK；NLK可以使TCF/ LEF 磷酸化，可以阻止β-catenin-TCF/ LEF 復合體綁定DNA 進而抑制β-catenin-TCF/ LEF 復合體活化基因的轉錄[4]。

最新研究顯示，不同類型Wnt 通路分子在干細胞的定向分化過程中具有不同作用。Wnt1，wnt3a 的表達導致wnt 經(jīng)典信號通路的增強由此可以導致MSC 礦化能力受阻[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)Wnt4 通過激活非β-catenin 通路(主要是Wnt/Ca2+與Wnt/ PCP 通路聯(lián)合作用)，促進MSCs 向成骨細胞分化，在顱面部和牙周缺損模型中表現(xiàn)出強勁的骨形成能力，促進缺損修復[6]。但炎癥微環(huán)境影響牙周膜干細胞成骨分化的過程中是否有Wnt 非經(jīng)典信號通路的參與，目前相關報道較少。本實驗擬體外獲取慢性牙周炎組織來源的PDLSC并探討非經(jīng)典Wnt/ Ca2+信號通路在其成骨分化過程中的作用機制。

1. 材料方法

1.1 材料 胎牛血清，α-MEM 培養(yǎng)基，Ⅰ型膠原(Gibco BRL)；0.25%胰蛋白酶(Sigma， St Louis， MO， USA)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；實時定量PCR 儀IQ 5(美國)；RNA 抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒Fermentas(美國)；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和引物上海生物工程公司(中國)； Syber Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒Takara(日本)。Western 及IP 裂解液，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)；CaMKII抗體NLK 抗體(Millipore，美國)；Runx 2 抗體ALP 抗體(Abcam，美國)；β-Actin，羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2 離體牙樣本收集 收集因治療需要拔除的健康以及慢性牙周炎病例樣本。正常牙周膜組織來源于因正畸需要拔除的無齲前磨牙及第三磨牙；炎癥牙周膜組織來源于慢性牙周炎患者，慢性牙周炎的診斷標準參照Armitage 的推薦標準[6]：X 線片顯示牙槽骨吸收達到牙根2/ 3，一個以上的牙周袋探診深度≥5mm。所有納入個體均無系統(tǒng)性疾病及已知的可以影響牙周狀況的疾病，無吸煙史，近6 個月無特殊服藥史。所有組織樣本均來自于解放軍總醫(yī)院口腔科，項目在患者知情同意的條件下進行。

1.3 牙周膜干細胞的體外培養(yǎng) 正常組織來源牙周膜干細胞H-PDLSCs 及炎癥組織來源牙周膜干細胞P-PDLSCs 的體外培養(yǎng)遵循本實驗室前期的實驗步驟[7]。在超凈工作臺將拔除后的牙齒經(jīng)0.01mol/ L PBS 沖洗5-7 次后，用冠根單向刮取根中/ 下三分之一的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，Ⅰ型膠原酶消化15min 后，離心管內(nèi)的組織離心800r/ min。棄上清后重懸并放置在6 孔板中(含15%、胎牛血清)、100μm/ L 抗壞血酸、0.292mg/ ml 谷氨酰胺、100units/ ml 青霉素/ 鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基)。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)5-8d，直至有細胞從組織塊邊緣爬出。細胞生長達80%匯合時用胰酶/ EDTA(0.25/ 0.1，pH=6.4)消化傳代，標記為第一代。采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人正常及炎癥組織來源的牙周膜干細胞，取3-4 代細胞進行實驗。

1.4 成骨誘導試驗 將多克隆來源的P-PDLSCs 和H-PDLSCs 制成細胞懸液，以5×104個/ ml 的密度接種于6 孔板中，用10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)24h，待細胞伸展至60%-70%匯合后換礦化誘導液(含5mmol/ L β-甘油磷酸鈉，50μg/ ml 維生素C， 1×10-8mol/ L 地塞米松、10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)，每隔3d 換液一次，根據(jù)不同實驗內(nèi)容進行觀察培養(yǎng)。

1.5 細胞免疫化學熒光染色 將生長狀況良好的處于對數(shù)生長期的P3 代單克隆培養(yǎng)獲得的H-PDLSCs 及P-PDLSCs 調(diào)整密度至5×103/ cm2密度接種至24 孔板，37℃、5%CO2、95%空氣條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后PBS 沖洗兩遍，將H-PDLSCs 及P-PDLSCs 各設置兩組，一組常規(guī)換液作為對照，而另一組則加入成骨誘導液，成骨誘導3d 后4%多聚甲醛常溫固定40min，PBS沖洗3 遍，0.25%TritonX100， 37℃孵育20min，加入相應一抗，CaMKII(Millipore， USA)一抗?jié)舛葹?∶100，避光滴加FITC 標記的羊抗兔二抗(Pierce， USA；1 ∶800)，孵 育 完 成 后，Hoechst 33342(50g/ ml， Sigma)襯染細胞核15min。熒光顯微鏡下觀察，用DP controller(Olympus)和DP manager 軟件處理圖像。

1.6 實時定量PCR 檢測 將H-PDLSCs 及P-PDLSCs 成骨誘導液7d 后用Trizol 裂解并提取總RNA，測定RNA 濃度，分別反轉錄為cDNA。逆轉錄所得cDNA 利用Syber Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒進行熒光定量PCR 檢測，反應體系均為20μl 。引物序列：CaMKII(Ca2+/ 鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶Ⅱ)：fo rward5' -CGCCCGGCACCCGGGGTGCGC-3' ， reverse 5' -CAGAGGAGCACCGAGCCTTC-3' ； NLK (Nemo

樣激酶）：forward5' -AGGCTCCTGAGAATCAACCCAAC-3' ， reverse5' -CCACGGTAATTGACCAACCTCTG-3' ；Runx2(Runt 相關因子2)：forward: 5' -CCCGTGGCCTTCAAGGT-3' ， reverse: 5' -CGTTACCCGCCATGACAGTA-3' ；β-Actin：orward5' -TGGCACCCAGCACAATGAA-3' ，reverse 5' -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' 。反 應 條 件: 95℃變 性20min， 95℃30s， 60℃1min， 40 個 循 環(huán)。IQ5 型實時熒光定量PCR 儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結果根據(jù)標準曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復性和擴增效率。本實驗進行三次重復。

1.7 Western blot 檢測細胞中的蛋白表達 采用細胞裂解液試劑盒分別提取對照組及成骨誘導7d 組P-PDLSCs 與H-PDLSCs 的總蛋白，測定蛋白樣本濃度，制備蛋白樣品。配置10%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS 電泳液，依據(jù)蛋白定量結果進行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍進入分離膠后調(diào)整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉移電泳槽(200 mA， 2h) 中轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF) 膜。用TBST 配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液對PVDF 膜封閉2h，PVDF膜封閉一抗Runx2、ALP、CaMKII、NLK(1∶1000)稀釋，以β-Actin 為內(nèi)參，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF 膜，復溫1h TBST 洗膜，每次5min，共計3 次。按說明書加入相應濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST 洗脫二抗，每次10min，共計3 次。漂洗膜后加入電化學發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。采用ImageJ 對WB 檢測正常及炎癥微環(huán)境中PDLSCs 成骨分化過程中關鍵成骨蛋白及Wnt 非經(jīng)典信號通路蛋白水平灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行相關數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；P＜0.05 差異有顯著性。進行多組間比較時，P值進行Bonferroni 校正。

2. 結果

2.1 H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨誘導3d后免疫熒光檢測胞漿內(nèi)CaMKII 的表達 我們將H-PDLSCs 與P-PDLSCs 接種于24 孔板細胞密度達到70%左右時加入成骨誘導液誘導3d，顯微鏡下檢測Wnt/ Ca2+信號通路細胞漿內(nèi)中游途徑關鍵蛋白CaMKII 的表達。免疫熒光結果顯示未經(jīng)誘導的H-PDLSCs 與P-PDLSCs 對照組細胞漿內(nèi)表達CaMKII，結果圖示中紅色熒光表達即為CaMKII。在成骨誘導液的作用下無論H-PDLSCs還是P-PDLSCs 細胞漿內(nèi)的CaMKII 的熒光表達強度較其各自對照組增強(圖1)。

圖1 免疫熒光染色檢測細胞內(nèi)CaMKII 的表達。細胞放大倍數(shù)×200

2.2 正常及炎癥組織來源PDLSCs 成骨誘導7d 后Wnt 非經(jīng)典通路關鍵基因及成骨轉錄因子的表達 實時定量PCR 結果顯示常規(guī)培養(yǎng)條件下CaMKII 在H-PDLSCs 與P-PDLSCs 中的表達不存在顯著性差異，當成骨誘導后H-PDLSCs 與P-PDLSCs 中CaMKII 的表達量顯著增高，其中H-PDLSCs 增高比例為5.5876 倍，而P-PDLSCs的增高比例為3.78 倍(圖2A)。NLK 是細胞核內(nèi)的一種關鍵基因可影響基因的轉錄和翻譯，常規(guī)培養(yǎng)條件下P-PDLSCs 中NLK 的表達水平顯著高于H-PDLSCs，成骨誘導后兩種組織來源細胞中NLKmRNA 的表達水平均有顯著性升高但H-PDLSCs 組顯著高于P-PDLSCs 組(圖2B)。Runx2 的檢測結果與我們前期試驗結果一致成骨誘導后H-PDLSCs 組顯著高于P-PDLSCs 組(圖2C)。

圖2 成骨誘導7 天后Real Time PCR 檢測檢測CaMKII(A)、NLK(B)和Runx2(C)表達。與未經(jīng)成骨誘導的H-PDLSCs 相比，*P＜0.05；與成骨誘導的H-PDLSCs 相比，# P＜0.05。

2.3 Wnt / Ca2+信號通路的激活可以提高P-PDLSCs 的成骨分化能力 Wnt / Ca2+信號通路關鍵蛋白的檢測WB 結果顯示：在常規(guī)培養(yǎng)的條件下H-PDLSCs 與P-PDLSCs 細胞中CaMKII以及NLK 的表達水平無明顯變化，但是成骨誘導7d 后二者的表達量均顯著增高(圖3)。同時發(fā)現(xiàn)，P-PDLSCs 細胞CaMKII、NLK 成骨誘導后的表達水平低于H-PDLSCs。Runx2、ALP 是成骨的關鍵蛋白，經(jīng)過7d 的成骨誘導液進行定向誘導之后可見H-PDLSCs 與P-PDLSCs 兩種蛋白的表達水平均顯著增高，但P-PDLSCs 中二者的水平低于H-PDLSCs(圖3)。

3. 討論

牙周病治療的理想結果是獲得牙周支持組織包括牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的完全再生。組織工程技術為牙周治療開辟了新的途徑，牙周膜干細胞作為種子細胞在其中發(fā)揮重要作用。牙槽骨保持著穩(wěn)定的生理性動態(tài)平衡，當這種平衡受到干擾后則表現(xiàn)出病理性過程，維持上述平衡的是間充質(zhì)干細胞，同時干細胞的各項功能受到嚴密的分子調(diào)控。前期我們的研究結果表明，慢性牙周炎組織來源的牙周膜干細胞的成骨分化能力降低，這即是牙周組織再生能力下降的關鍵因素之一[7，8]。

干細胞向成骨細胞分化的過程中，受到多種細胞因子、生長因子信號通路的調(diào)控，比較經(jīng)典的如BMP、Wnt、Notch、FGF、PI3K/ Akt 等，這些信號通路最終匯聚到成骨細胞的關鍵轉錄因子Runx2，影響Runx2 的轉錄和成骨細胞的分化。其中Wnt 信號通路是公認的在干細胞骨向分化過程中對細胞的增殖和分化起指導作用的一種重要的信號系統(tǒng)，在牙周膜干細胞成骨分化的過程中研究較多的為Wnt 經(jīng)典信號通路[9]。但是，Wnt 經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路在干細胞向軟骨細胞分化以及細胞外基質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，對不同時期、不同部位軟骨形成不僅有正調(diào)控作用，還有負調(diào)控作用。非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號通路通過鈣依賴性激酶、鈣調(diào)蛋白和轉錄因子N-F-AT 起作用。越來越多的研究表明，細胞內(nèi)Ca2+震蕩和維持未分化人干細胞的穩(wěn)定之間存在密切的聯(lián)系。激活Wnt／Ca2+信號通路可以導致細胞內(nèi)Ca2+的釋放，從而激活CaMKⅡ，以及pkc(protein kinase C，PKC)，雖然眾多研究報道G 蛋白參與在Wnt／Ca2+信號通路，但是目前尚無G proteins 與Frizzleds 蛋白直接結合的證據(jù)，CAMKII 則為非經(jīng)典信號通路中游的關鍵蛋白[10]。目前還有研究表明在非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號通路中TAK-TAB作為支架蛋白在該信號通路中發(fā)揮重要作用，二者結合后可與NLK 結合啟動下游分子信號，可使NLK 進入胞核，可以與一些特定的轉錄因子發(fā)揮作用。本實驗通過免疫熒光檢測手段檢測到正常及炎癥組織來源PDLSCs 細胞漿內(nèi)均表達非經(jīng)典Wnt 信號通路的中游關鍵蛋白CaMK Ⅱ，而在H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨誘導后CaMKⅡ表達的熒光強度出現(xiàn)變化，這提示非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號通路參與了正常及炎癥組織來源牙周膜干細胞的成骨分化。

為了進一步準確的探尋Wnt / Ca2+信號通路在成骨誘導作用下是否參與了P-PDLSCs 成骨分化及調(diào)控，我們對CaMKII 與NLK 做出了相應檢測。發(fā)現(xiàn)在成骨誘導后H-PDLSCs 與P-PDLSCs細胞中CaMKII、NLK 的表達水平顯著增高，這說明成骨誘導的微環(huán)境可以激活非經(jīng)典Wnt / Ca2+信號通路。但是我們發(fā)現(xiàn)，炎癥微環(huán)境作用下CaMKII、NLK 的表達水平低于正常組織來源的干細胞。此外，我們從基因及蛋白水平分別檢測了H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨分化過程中的關鍵分子。結果表明，無論是成骨轉錄因子Runx2 還是成骨關鍵蛋白ALP 的表達水平在H-PDLSCs與P-PDLSCs 成骨誘導7d 后均有所升高，但是P-PDLSCs 中兩種關鍵分子的水平低于H-PDLSCs。鈣離子的沉積量是骨形成的關鍵，CaMKII 在細胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)鈣離子的狀態(tài)影響骨的形成。在非經(jīng)典Wnt / Ca2+信號通路中CaMKII處于該信號的中游水平，可以間接的作用于其下游的NLK，NLK 蛋白與支架蛋白結合后可以進入細胞核與其相應的轉錄因子結合而改變干細胞的功能[11，12]。

在激活Wnt/ Ca2+信號通路后NLK 與其支架蛋白TAK-TAB 結合后可進入細胞核，在細胞核內(nèi)NLK 可以抑制TCF/ LEF 復合體結合DNA，以此抑制細胞增殖。我們的研究結果表明，無論正常組織來源的還是炎癥組織來源的PDLSCs 成骨誘導7d 后都可以發(fā)現(xiàn)CaMKII 和NLK 水平的升高。結合目前的研究前沿我們認為干細胞分化過程中Wnt 經(jīng)典與非經(jīng)典信號通路共同發(fā)揮作用，二者之間的變化趨勢也證實了二者存在相互作用，在調(diào)控干細胞介導的骨再生過程發(fā)揮關鍵作用。但Wnt 非經(jīng)典信號通路在細胞漿內(nèi)活化鈣離子及在胞核內(nèi)啟動相應的下游靶基因的復雜作用機制仍需深入探討。

[1] Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J]. Lancet，2004，364:149-155

[2] Yang N，Wang G，Hu C，et al.Tumor necrosis factor α suppresses the mesenchymal stem cell osteogenesis promoter miR-21 in estrogen deficiency-induced osteoporosis [J].J Bone Miner Res，2013，28(3):559-573

[3] Liu Y，Liu W，Hu C，et al.MiR-17 modulates osteogenic differentiation through a coherent feed-forward loop in mesenchymal stem cells isolated from periodontal ligaments of patients with periodontitis[J]. Stem Cells，2011，29(11):1804-1816

[4] Ishitani T，Kishida S，Hyodo-Miura J，et al. The TAK1-NLK mitogen-activated protein kinase cascade functions in the Wnt-5a/ Ca (2+) pathway to antagonize Wnt/ beta-catenin signaling[J]. Mol Cell Biol，2003，23:131-139

[5] Liu G，Vijayakumar S，Grumolato L，et al.Canonical Wnts function as potent regulators of osteogenesis by human mesenchymal stem cells[J]. J Cell Biol，2009，185:67-75

[6] Chang J，Sonoyama W，Wang Z，et al. Noncanonical Wnt-4 signaling enhances bone regeneration of mesenchymal stem cells in craniofacial defects through activation of p38 MAPK[J]. J Biol Chem，2007，282:30938-30948

[7] 劉 娜，蔣貴新，張 博，等.糖原合成酶激酶3 對炎癥狀態(tài)下牙周膜干細胞成骨分化能力的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2014，12(3):129-133

[8] 聶 嘉，張 博，顧 斌，等.p38 絲裂原活化蛋白激酶在炎癥微環(huán)境作用下對牙周膜干細胞成骨分化的影響[J].中國醫(yī)學科學院學報，2015，37(1)：1-7

[9] Liu W， Konermann A， Guo T， et al. Canonical Wnt signaling differently modulates osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and from periodontal ligament under inflammatory conditions [J].Biochim Biophys Acta，2014，1840(3):1125-1134

[10] Slusarski DC，Pelegri F. Calcium signaling in vertebrate embryonic patterning and morphogenesis [J]. Dev Biol，2007，307(1):1-13

[11] Suzawa M，Takada I，Yanagisawa J，et al. Cytokines suppress adipogenesis and PPAR-gamma function through the TAK1/ TAB1/ NIK cascade[J]. Nat Cell Biol，2003，5(3):224-230

[12] Katoh M. STAT3-induced WNT5A signaling loop in embryonic stem cells， adult normal tissues， chronic persistent inflammation，rheumatoid arthritis and cancer[J]. Int J Mol Med，2007，19:273-378