銅脅迫對雙穗雀稗生理特性及銅積累的影響

張 靜 梁克中 陳秀紅 余順慧 祁俊生

（重慶三峽學(xué)院，三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點實驗室，重慶萬州 404100）

銅脅迫對雙穗雀稗生理特性及銅積累的影響

張 靜 梁克中 陳秀紅 余順慧 祁俊生*

（重慶三峽學(xué)院，三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點實驗室，重慶萬州 404100）

本研究探索銅脅迫對雙穗雀稗（Paspalum Distichum L.）的毒害機制，為銅污染水體植物修復(fù)提供理論依據(jù)．闡明了三峽庫區(qū)消落帶適生植物雙穗雀稗在不同濃度Cu2+作用下新芽數(shù)、葉綠素含量、抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及重金屬銅累積與分布的影響．結(jié)果表明：在0～40 mg/L Cu2+濃度處理范圍內(nèi)，Cu2+濃度在0～10 mg/L時對雙穗雀稗抗氧化酶系統(tǒng)和葉綠素含量及新芽數(shù)均有促進作用；但隨著Cu2+濃度的不斷增大，雙穗雀稗抗氧化酶系統(tǒng)活性明顯下降，Cu2+濃度增加到一定程度后，POD活性又稍微上升．當(dāng)Cu2+濃度＞10 mg/L時，雙穗雀稗的新芽數(shù)和葉綠素含量減少．雙穗雀稗主要通過根、莖積累Cu2+，且表現(xiàn)為積累量根＞莖；雙穗雀稗可以有效降低水體、土壤中Cu2+的含量，在三峽庫區(qū)消落帶庫岸植物修復(fù)中具有潛在應(yīng)用價值．

銅脅迫；雙穗雀稗；生理特性；銅積累

1 引 言

銅是植物必需微量營養(yǎng)元素，參與植物的光合作用以及呼吸作用，并且與葉綠素的形成有關(guān)，同時也是環(huán)境污染重金屬元素．由于三峽庫區(qū)工礦企業(yè)等的發(fā)展及農(nóng)用化肥大規(guī)模的使用，許多重金屬銅進入庫區(qū)消落帶，加快其循環(huán)，通過生物放大嚴(yán)重影響人們的健康．所以，目前研究的熱點之一是如何去除三峽庫區(qū)消落帶水體及土壤中重金屬．總結(jié)前人研究，發(fā)現(xiàn)植物修復(fù)具有許多優(yōu)點，但它的難點在于超積累植物的篩選及應(yīng)用[1]．目前已知的超積累植物大多具有入侵性，具有一定的生態(tài)風(fēng)險．而雙穗雀稗不是超積累植物，適合生長在消落帶，是消落帶庫岸植被修復(fù)與重建的優(yōu)良物種之一[1-3]．之前，大量研究者盡管在植物耐重金屬方面做了相當(dāng)多的研究，比如：本實驗室做了狗牙根修復(fù)銅及鉛污染土壤和水體方面的研究，并且取得了一定的進展[4-7]．但就雙穗雀稗對銅污染的土壤、水體修復(fù)及銅積累特性的研究相對比較匱乏．為此，以雙穗雀稗為研究材料，通過水培實驗，研究了不同濃度梯度銅脅迫條件下對雙穗雀稗植物新芽數(shù)、葉綠素含量、抗氧化酶系統(tǒng)及重金屬銅累積與分布的影響，以期為消落帶植被重建過程中物種的篩選、環(huán)境修復(fù)技術(shù)提供一定的科學(xué)理論依據(jù)．

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 供試材料 雙穗雀稗：于2014年4月采于重慶市萬州區(qū)牌樓消落帶．

2.1.2 試劑 CuSO4?5H2O（AR），Hoagland營養(yǎng)液（使用AR藥品配制而成）．

2.1.3 儀器 TDZ5-WS多管架自動平衡離心機（賽特湘儀器有限公司）、MARS240微波消解系統(tǒng)（美國CEM公司）、紫外分光光度計（T6新世紀(jì)）、AA-6300原子吸收分光光度計（日本島津公司）．

2.2 實驗方案設(shè)計

共設(shè)5個不同銅濃度，分別為：0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，以模擬Cu2+污染環(huán)境．每組設(shè)3個平行實驗．

2.3 實驗方法

2.3.1 材料預(yù)處理 植物采回后，選取生物量大約相同的幼苗移栽到實驗室土壤中培養(yǎng)直至長出新芽．將長出新芽的植株用自來水、去離子水沖洗至去離子水中檢測不出Cu2+后，將其放于裝有65 mL的Hoagland營養(yǎng)液的廣口瓶中純化水培培養(yǎng)．待植株長出新根后，將上述植株放入加有不同濃度（銅以CuSO4?5H2O形式加入）的營養(yǎng)液中脅迫處理．實驗過程中需保證24 h連續(xù)通氣，白天將其移到室外保證其充分光照．隨時補充液體，每五天更換一次營養(yǎng)液．為了避免營養(yǎng)液產(chǎn)生沉淀，KH2PO4濃度降低為0.005 mmol/L．實驗過程中每24小時查看一次植株生長狀況，處理8天后立即收獲植株及時測定其相應(yīng)的指標(biāo)．

2.3.2 生理指標(biāo)的測定 采用“南京建成生物工程研究所”購買的SOD、POD試劑盒測定SOD、POD的活性．分別用分光光度法[8]、丙酮—乙醇分光光度法[9]，測定CAT活性以及葉綠素含量．

2.3.3 銅含量的測定 用去離子水洗凈處理8天后收獲的雙穗雀稗，將其根、莖分離，在鼓風(fēng)干燥箱中烘干（80oC）處理待用．稱取一定質(zhì)量放入磨砂研缽內(nèi)研磨至均勻的粉末，精確稱取0.200 0 g供試樣品于消解罐中，加入混酸（濃H2SO4︰濃HNO3= 1︰4）．將其消解冷卻后過濾，定容至25 mL容量瓶中保存待測，用AA-6300原子吸收分光光度計測定樣品Cu2+含量，單位為mg/kg干重．同時做空白組．

2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理、分析使用Origin8.0軟件進行．

3 結(jié)果與分析

3.1 Cu2+脅迫對雙穗雀稗生長的影響

由圖1能夠看出，雙穗雀稗在外源Cu2+脅迫條件下，隨著Cu2+濃度逐漸變化對雙穗雀稗的生長有顯著的影響，具體表現(xiàn)如下：外源Cu2+濃度在0～10 mg/L時，隨著Cu2+濃度的增加，雙穗雀稗的新芽數(shù)不斷增加，10 mg/L時新發(fā)芽數(shù)達到峰值，可能是由于低濃度的Cu2+在一定程度上促進雙穗雀稗的生長，導(dǎo)致新芽數(shù)比空白組的增加；外源Cu2+脅迫濃度從10～40 mg/L增加時，隨著培養(yǎng)時間的增加，雙穗雀稗的新芽數(shù)呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，甚至在40 mg/L時雙穗雀稗的新芽數(shù)是零，說明了Cu2+在40 mg/L時對雙穗雀稗的脅迫作用最大，癥狀最明顯，第8天后死亡．表明低濃度Cu2+有利于雙穗雀稗生長，濃度較高時反而不利于其生長．表現(xiàn)出傷害癥狀時，高濃度Cu2+處理的雙穗雀稗植株生長比較遲緩，植株矮小，葉片逐漸失水干枯．（注：定時每天查看雙穗雀稗生長狀況以及癥狀表現(xiàn)．）

3.2 Cu2+脅迫對雙穗雀稗葉綠素含量的影響

由圖2知，雙穗雀稗經(jīng)Cu2+處理后，Cu2+濃度在0～10 mg/L時，雙穗雀稗葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a + b的含量逐漸上升，此時，葉綠素在Cu2+脅迫初期（0～10 mg/L時）表現(xiàn)出一定的抗逆性．隨著Cu2+濃度的進一步增大（10～40 mg/L），色素含量呈現(xiàn)下降的趨勢，故葉綠體結(jié)構(gòu)破壞．原因可能是由于高濃度Cu2+進入植物體細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞器葉綠體中的葉綠素加快分解，致使葉綠素蛋白中心離子組成發(fā)生變化而出現(xiàn)失活[11]．

3.3 Cu2+脅迫對雙穗雀稗SOD、POD、CAT活性的影響

一起構(gòu)成植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的是超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT），它們之間相互協(xié)調(diào)共同作用，可以有效清除植物細胞內(nèi)的自由基等[5,6]．

3.3.1 對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD是重要的自由基清除酶，以防御自由基對細胞產(chǎn)生毒害作用（如在重金屬脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，SOD能及時將其清除）．由圖3可以看出，一定銅離子濃度范圍內(nèi)，隨著外源銅濃度增加，雙穗雀稗葉片的SOD酶活性顯著升高，Cu2+濃度為10 mg/L時，SOD活性為最大；但隨外源銅濃度的進一步升高（10～40 mg/L），SOD酶活性逐漸降低．這可能是由于Cu2+在雙穗雀稗體內(nèi)積累量超過一定臨界值（10 mg/L）時導(dǎo)致雙穗雀稗細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基超過了保護酶系統(tǒng)的清除能力．這與周長芳等的研究結(jié)果相一致[14]．

圖1 銅脅迫對雙穗雀稗植株新芽數(shù)的影響Fig．1 Effects of Cu2+stress on new sprout number of P. Distichum

圖2 Cu2+脅迫對雙穗雀稗葉綠素含量的影響Fig2 Effects of Cu2+stress on chlorophyll content in leaves of P. Distichum

3.3.2 對過氧化物酶（POD）活性的影響

POD也是植物抗氧化系統(tǒng)中重要的自由基清除酶．POD清除自由基的原理是可以把SOD的歧化產(chǎn)物過氧化氫轉(zhuǎn)化為水．逆境較嚴(yán)重時可誘使植物細胞內(nèi)生成更多自由基，導(dǎo)致POD活性增強．所以，如果POD活性較高時，植物組織可能受到損害以及破壞的程度越嚴(yán)重．從圖3可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著外源Cu2+濃度增加，雙穗雀稗葉片的POD酶活性呈現(xiàn)出略微上升的趨勢，在10 mg/L時達到最大；Cu2+濃度 > 10 mg/L時，POD活性緩慢下降，而后POD活性又增大．但POD活性隨著外源銅離子濃度增加總體是呈上升趨勢．前段上升的原因，可能是銅脅迫對雙穗雀稗POD活性起到了誘導(dǎo)作用；下降原因，可能是隨著外源銅濃度的增大，雙穗雀稗超氧自由基的生成量較高，超出了POD酶清除超氧自由基的能力，導(dǎo)致植物體內(nèi)自由基的清除與產(chǎn)生失衡；后期POD活性上升，可能是由于植株衰老引起．這與余順慧等的研究所得結(jié)論相同[6]．

3.3.3 對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

CAT酶是促使過氧化氫分解成分子氧和水的生物催化劑，因此能夠清除植物細胞內(nèi)的過氧化氫，從而讓植物細胞避免被過氧化氫毒害[6]．由圖3可以看出，在一定銅濃度范圍內(nèi)，隨著外源Cu2+濃度增加，雙穗雀稗葉片的CAT酶活性先升后降，上升的原因可能是植物在低濃度的Cu2+脅迫下，其葉片內(nèi)隨著SOD活性升高，歧化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫增多，導(dǎo)致CAT酶底物濃度增加所致；下降的原因可能是由于在高濃度Cu2+作用下CAT活性表現(xiàn)出抑制作用，植株在長期受到高濃度重金屬離子作用后，造成CAT酶分子內(nèi)在結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變．這與余順慧等的研究結(jié)果一致[6]．

圖3 Cu2+脅迫對雙穗雀稗SOD、POD、CAT活性的影響Fig3 Effects of Cu2+stress on activities of SOD、POD、CAT in leaves of P. Distichum

3.4 Cu2+脅迫對雙穗雀稗積累銅及分布情況的影響

隨著營養(yǎng)液中外源Cu2+濃度增大，雙穗雀稗根和莖累積Cu2+的百分比顯著增大（見表1）．當(dāng)水體被重金屬污染后，重金屬利用水體—植物系統(tǒng)進入雙穗雀稗細胞內(nèi)，隨著外源重金屬的增加，導(dǎo)致雙穗雀稗根、莖中重金屬含量百分比顯著增大，其遷移富集量表現(xiàn)為根 > 莖．由表1可知，跟空白組比較，在用不同的Cu2+脅迫處理后，雙穗雀稗莖和根中Cu2+的質(zhì)量百分比變化比較明顯．因此可以推斷，雙穗雀稗主要通過根富集重金屬離子．

表1 Cu2+在雙穗雀稗植物體內(nèi)的積累和分布情況(比例）Table1 Accumulation and distribution of Cu2+in P. Distichum

4 討 論

銅是植物必需微量元素之一，影響著植物的生長發(fā)育[12]，通過研究，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)Cu2+脅迫作用下，可以提高雙穗雀稗的新芽數(shù)，促進其生長，但超出一定濃度范圍后，雙穗雀稗的新芽數(shù)降低，直至死亡．

葉綠素是植物進行光合作用生成有機物的重要色素，其含量將直接反映出植物光合作用能力的強弱，進而影響著植物的生長能力．低濃度的銅脅迫對葉綠素的形成有一定的促進作用，但超過一定濃度范圍后，反而抑制葉綠素的形成[13]．

抗氧化酶系統(tǒng)的活性直接影響著植株細胞內(nèi)氧化物、自由基等的代謝與清除．高活性抗氧化酶有利于提高植物對各種外界脅迫（生物及非生物）的耐受性[12]．通過本研究可以得出，低濃度銅處理草本植物雙穗雀稗時SOD、POD、CAT活性均有增加，而高濃度銅處理則表現(xiàn)出一定的抑制作用，具體表現(xiàn)為：SOD和CAT降低，POD活性隨著銅濃度的增加，逐漸升高，POD酶活性總體呈上升趨勢．這可能是由于銅脅迫對雙穗雀稗POD活性起到誘導(dǎo)作用，而且POD也可在逆境或衰老后期進行有效表達，并參與葉綠素的分解作用，表現(xiàn)為傷害效應(yīng)．

在本研究中，隨著外源Cu2+濃度增大，雙穗雀稗莖和根累積銅離子的百分比明顯增多，富集量表現(xiàn)為根 > 莖，這一結(jié)果與邱喜陽等的研究結(jié)果一致[2]．在本試驗中，當(dāng)外源銅濃度是40 mg/L時，植物雖然出現(xiàn)傷害癥狀，雙穗雀稗地上及地下部分富集銅百分比仍然較高，分別是31.76%和68.24%，雖然這種草本植物不屬于超富集植物，但考慮到雙穗雀稗既耐水淹又耐干旱，而且生長迅速，生物量大，綜上，雙穗雀稗可用于銅污染水體、土壤修復(fù)．

5 結(jié) 論

（1）在低濃度銅處理時，雙穗雀稗的新芽數(shù)、葉綠素含量、SOD活性、CAT活性、POD活性有一定促進作用，而高濃度的銅脅迫對植物的上述指標(biāo)有抑制作用，其中POD活性表現(xiàn)出其特殊性，即總體趨勢為上升．

（2）盡管雙穗雀稗不是Cu2+的超積累植物，但是從其富集Cu2+的能力以及長期耐水淹等方面考慮，在使用生物修復(fù)技術(shù)治理Cu2+污染的環(huán)境中具有潛在應(yīng)用價值，綜合考慮，雙穗雀稗能夠作為三峽庫區(qū)消落帶環(huán)境（水體、土壤）修復(fù)的優(yōu)良物種．

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（責(zé)任編輯：張新玲）

Effects of Cu2+Stress on Physiological Properties of Paspalum Distichum and Copper Accumulation

ZAHNG Jing LIANG Kezhong CEHN Xiuhong YU Shunhui QI Junsheng*
(Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservior, Wanzhou, Chongqing, 404100, China)

This paper clarifies the poisoning mechanism of the copper stress on Paspalum distichum (Paspalum Distichum L.) to provide a theoretical basis for copper phytoremediation of polluted water body. In this hydroponic experiment, CuSO4.5H2O was added into Hoagland solution to simulate the Three Gorges Reservoir water pollution Cu2+. It clarifies the appropriate plants in Three Gorges Reservoir with a double spike paspalum at different concentrations, Cu2+effect sprout number, chlorophyll content, antioxidant enzyme superoxide dismutase system (SOD), peroxidase (POD), catalyse (CAT) activity and the cumulative effects and distribution of heavy metals copper. The results show that: in the 0 ~ 40mg L Cu2+inside / concentrations range, Cu2+concentration in the 0 ~ 10 mg / L when Paspalum distichum chlorophyll content and antioxidant enzyme systems and the number of new shoots are promoted; but with Cu2+concentration increases, Paspalum distichum decreases antioxidant enzyme system activity, Cu2+concentration increases to a certain extent, POD activity also increases slightly. When Cu2+concentration is > 10 mg / L, the number of shoots and chlorophyll content Paspalum distichum reduces. Paspalum distichum accumulates Cu2+mainly through the roots, stems, and the performance of the accumulation of roots is > stems; Paspalum distichum can effectively reduce the water level, Cu2+content in soil. It is of much potential value in Phytore remedy in the Three Gorges Reservoir of Yangtze River .

Cu2+stress;Paspalum Distichum; Physiological characteristics; Cu2+uptake

Q945.7

A

1009-8135（2015）03-0109-05

2015-02-06

張 靜（1992-），男，重慶三峽學(xué)院在讀碩士，主要研究環(huán)境科學(xué).

祁俊生（1964-），男，重慶三峽學(xué)院教授，博士，主要研究環(huán)境科學(xué).

重慶高校市級重點實驗室開放基金項目“三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治”（WEPKL2012MS-01）階段性成果