YC-1體外調(diào)控卵巢癌化學(xué)治療敏感性*

黃金玲，洪莉，洪莎莎，閔潔，胡鳴，趙楊，楊青

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430060)

YC-1體外調(diào)控卵巢癌化學(xué)治療敏感性*

黃金玲，洪莉，洪莎莎，閔潔，胡鳴，趙楊，楊青

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430060)

目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑YC-1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A2780s順鉑化療敏感性的影響。方法 將培養(yǎng)好的卵巢癌細(xì)胞分為對(duì)照組、YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組，分別給予等量0.9%氯化鈉溶液、YC-1、順鉑、YC-1 +順鉑處理。Real time PCR檢測(cè)各組缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組HIF-1α和VEGF灰度值反應(yīng)蛋白表達(dá)量；比較各組間HIF-1α和VEGF表達(dá)水平差異，評(píng)價(jià)卵巢癌細(xì)胞微環(huán)境中缺氧程度及血管生成能力變化。結(jié)果 HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白在YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組中的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于順鉑組(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIF-1α與VEGF mRNA在各組間的表達(dá)水平呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.830 5)。結(jié)論 YC-1具有抗卵巢癌作用，與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)其化學(xué)治療敏感性。

3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑；缺氧誘導(dǎo)因子；癌，卵巢；順鉑；耐藥

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第 2 位。因其發(fā)病隱匿、病情發(fā)展迅速，病死率居于婦科惡性腫瘤之首，5 年生存率25%～30%[1]。對(duì)于中、晚期卵巢癌患者，手術(shù)后化學(xué)治療(化療)是主要治療手段，因此耐藥與藥物不良反應(yīng)是影響治療效果的重要因素。順鉑目前被廣泛用于多種惡性腫瘤化療，也是卵巢癌化療的臨床一線用藥，但耐藥問題普遍存在，嚴(yán)重影響化療效果，導(dǎo)致不良預(yù)后比例增加，因此尋找改善其耐藥狀況的有效手段是亟待解決的問題。

研究認(rèn)為，惡性腫瘤中缺氧微環(huán)境的形成與腫瘤的惡性侵襲能力及耐藥性密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是介導(dǎo)腫瘤缺氧適應(yīng)并促進(jìn)腫瘤生長的關(guān)鍵因子，同時(shí)在基因水平直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，導(dǎo)致血管大量增生，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤生長失控、耐藥性增加[2]。

3-(5′-羥甲基-2′-呋喃基)-1-苯甲基吲唑[1-benzyl-3- (5-hydroxymethylfur-2-yl) indazole ，YC-1]是一種人工合成物的HIF-1抑制藥，可從多方面抑制腫瘤生長，如細(xì)胞周期抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗腫瘤血管生成等，已有細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)其在治療肝癌及宮頸癌等方面的價(jià)值[3]，筆者在本實(shí)驗(yàn)中將YC-1與順鉑聯(lián)合作用于卵巢癌細(xì)胞A2780s，觀察其抗卵巢癌、增加順鉑化療敏感性的效果，以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株A2780s，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 藥品與試劑 Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies，目錄號(hào)：15596-026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo生產(chǎn)，目錄號(hào)：#K1622)；定量PCR試劑盒[FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，Roche生產(chǎn)，目錄號(hào)：04 913914 001]；引物：由Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成；兔抗人Actin(Santa公司)、兔抗人HIF-1α、兔抗人VEGF(Epitomics公司)，二抗山羊抗兔(KPL公司)；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。YC-1(Enzo life sciences，批號(hào)：ALX-420-025-M001，含量：1 mg)

1.3 儀器與設(shè)備 離心機(jī)(Heal Force，型號(hào)：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R)；熒光定量PCR儀(SLAN熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn))；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰，型號(hào)：SW-CJ-1FD)；離心管、TIP頭均購自Axygen Biosciences。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 細(xì)胞分組及處理 將細(xì)胞培養(yǎng)并傳代后制成1×107個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色示活細(xì)胞數(shù)>95%。將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組，每組3個(gè)樣本。對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液處理，YC-1組給予10 μmol·L-1YC-1，順鉑組給予10 μg·L-1順鉑，YC-1+順鉑組給予10 μmol·L-1YC-1 +10 μg·L-1順鉑。均孵育24 h。

1.4.2 Real time PCR 采用TriIzoL試劑提取總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作定量PCR，引物由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成，見表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果計(jì)算采用相對(duì)定量ΔΔCT法，即以內(nèi)參基因actin 為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣本相對(duì)于校準(zhǔn)樣本目標(biāo)基因的變化倍數(shù)，CT值為初始循環(huán)數(shù)，即擴(kuò)增產(chǎn)物累積增多至足以產(chǎn)生熒光信號(hào)時(shí)記錄下來的循環(huán)數(shù)，取3個(gè)樣本CT值的平均數(shù)，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)-△CT對(duì)照，擴(kuò)增倍數(shù)=2-△△CT，代表mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 藥物孵育后每組取106個(gè)細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)。經(jīng)Bradford法定量，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、反應(yīng)后分別加入兔抗人Actin、兔抗人HIF-1α、兔抗人VEGF，經(jīng)孵育過夜、二抗山羊抗兔反應(yīng)并顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以AlphaEase FC軟件掃描并分析圖象，計(jì)算灰度值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 Real time PCR結(jié)果

2.1.1 HIF-1α及VEGF mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)明顯低于YC-1組和順鉑組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

與對(duì)照組比較，*1P<0.05；與YC-1+順鉑組比較，*2P<0.05

圖1 4組細(xì)胞HIF-1α與VEGF mRNA表達(dá)情況

Compared with control group ，*1P<0.05；compared with YC-1 plus cisplatin group，*2P<0.05

Fig.1 mRNA expression of HIF-1α and VEGF in four groups of cells

2.1.2 HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，取95%可信區(qū)間，結(jié)果HIF-1α與VEGF mRNA 在各組的表達(dá)具有正相關(guān)性，r=0.830 5(圖2)。

圖2 HIF-1α與VEGF mRNA 相關(guān)性分析

Fig.2 Correlation analysis on mRNA expression of HIF-1α and VEGF

2.2 Western blot結(jié)果 在actin 蛋白表達(dá)基本一致的情況下，YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)低于對(duì)照組；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)低于YC-1組和順鉑組(圖3)。通過AlphaEase FC軟件計(jì)算灰度值，HIF-1α/actin及VEGF/actin代表蛋白表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，亦得到相似結(jié)果：YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α與VEGF蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α與VEGF mRNA表達(dá)低于YC-1組和順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖3 HIF-1α及VEGF 蛋白電泳結(jié)果

Fig.3 Protein electrophoresis of HIF-1α and VEGF

3 討論

卵巢癌化療耐藥是目前臨床導(dǎo)致卵巢癌死亡率高、預(yù)后差的重要因素之一，本研究從蛋白及mRNA水平證實(shí)YC-1降低卵巢癌細(xì)胞株A2780s中HIF-1α及血管生成因子VEGF的表達(dá)，改善了其中的缺氧狀態(tài)，抑制血管的生成，與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠增加卵巢癌細(xì)胞A2780s對(duì)順鉑化療的敏感性。

與對(duì)照組比較，*1P<0.05；與YC-1+順鉑組比較，*2P<0.05

圖4 HIF-1α及VEGF蛋白的表達(dá)灰度分析

Compared with control group，*1P<0.05；compared with YC-1 plus cisplatin group，*2P<0.05

Fig.4 Gradation analysis on the protein expression of HIF-1α and VEGF

研究證實(shí)，實(shí)體腫瘤中缺氧環(huán)境的形成是腫瘤生長失控、浸潤轉(zhuǎn)移、血管異常增生及腫瘤耐藥發(fā)生的關(guān)鍵微環(huán)境改變，其形成原因可能是因?yàn)槠渖L速度快，其中的新生血管生成相對(duì)緩慢，造成瘤體中部分缺氧區(qū)域，為了改善缺氧環(huán)境，腫瘤又進(jìn)一步產(chǎn)生了一系列誘導(dǎo)新生血管生成的機(jī)制以保證供氧，造成腫瘤中大量異形血管生成，而這種典型的惡性侵襲行為又進(jìn)一步增加了腫瘤的生存力和侵犯能力[4]。在這其中起到調(diào)節(jié)作用的HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)新生血管的生成中起到了關(guān)鍵作用。許多研究表明，HIF-1在實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長過程起正調(diào)節(jié)作用，意味著腫瘤的缺氧狀態(tài)，而缺氧又進(jìn)一步使腫瘤細(xì)胞變得更加不穩(wěn)定，增加腫瘤的侵襲力及對(duì)放化療的抵抗性[2]，因此近年來對(duì)HIF-1為靶點(diǎn)的研究逐漸增多。HIF-1包括α和β兩個(gè)亞基，目前發(fā)現(xiàn)HIF-α有3個(gè)亞型，分別為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵蛋白，HIF-1α的表達(dá)程度隨細(xì)胞內(nèi)氧濃度而變，缺氧狀態(tài)抑制了HIF-1α的降解，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的濃度升高。并且HIF-1α因其氧相關(guān)表達(dá)的特異性，在腫瘤治療中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：在缺氧環(huán)境、癌基因激活或抑癌基因失活時(shí)會(huì)被激活并過量表達(dá)，在正常組織中通過蛋白酶體途徑被降解，表達(dá)量很低[5]。

近年對(duì)于HIF-1α抑制藥的研究較多，其中YC-1為人工合成的一種化合物，最初主要應(yīng)用于血栓方面的研究，具有抑制血小板聚集、ATP釋放、磷酸肌醇分解的作用，并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子，在臨床上具有防治血管內(nèi)血栓形成的研究?jī)r(jià)值[3，6]。后來有研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞中能夠抑制HIF-1α及VEGF表達(dá)，抑制腫瘤的進(jìn)展[7]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)YC-1引起HIF-1α的下調(diào)，減少新生血管的生成[8]，抑制腫瘤的生長，而且并未發(fā)現(xiàn)YC-1引起嚴(yán)重的毒副作用或免疫抑制[9]，因此其作為抗腫瘤藥物在臨床應(yīng)用的潛在可能前景較為樂觀。本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)卵巢癌細(xì)胞株A2780s在經(jīng)過YC-1孵育之后其內(nèi)的HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，證明在卵巢癌細(xì)胞中YC-1可有效改善腫瘤缺氧狀態(tài)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。

另外本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，VEGF蛋白及mRNA表達(dá)降低提示血管生成受到抑制。VEGF是最主要的血管生成因子，也是目前研究最為熱點(diǎn)的腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞因子之一。VEGF在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均可合成分泌，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)卵巢癌組織中HIF-1 mRNA表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，HIF-1通過誘導(dǎo)VEGF分泌的增加促進(jìn)腫瘤新生血管形成[10]，本研究進(jìn)一步證實(shí)YC-1能夠抑制A2780s卵巢癌細(xì)胞株中的血管生成。

本實(shí)驗(yàn)中筆者通過體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，從蛋白和mRNA水平分別檢測(cè)癌細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示經(jīng)YC-1孵育后的卵巢癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而和順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性分析顯示兩組間正相關(guān)，已知HIF-1α與環(huán)境缺氧程度呈正相關(guān)，而VEGF反映腫瘤細(xì)胞中血管生成的能力，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示YC-1能夠改善卵巢癌當(dāng)中的缺氧狀況，抑制新生血管生成，有可能作為抗卵巢癌的藥物獨(dú)立使用。而YC-1+順鉑組中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于YC-1、順鉑單一用藥組，可見二者聯(lián)合應(yīng)用增加了卵巢癌細(xì)胞A2780s對(duì)順鉑化療的敏感性，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。但是對(duì)于YC-1增加順鉑化療敏感性的機(jī)制目前尚未完全明確。考慮可能是缺氧環(huán)境改善后抑制了相關(guān)耐藥基因的表達(dá)[11]，或可能因改善了缺氧環(huán)境而抑制了多藥耐藥基因MDRI中的低氧反應(yīng)原件，進(jìn)而改善了腫瘤耐藥性[12]。CHI等[11]在2007年即通過細(xì)胞體外培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩種途徑證實(shí)了YC-1下調(diào)肝癌中P-Stat3的表達(dá)，而后者是腫瘤化療耐藥的重要遞質(zhì)，YC-1與順鉑聯(lián)合用藥可增強(qiáng)肝癌的化療敏感性，而對(duì)于卵巢癌目前為止尚無相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)部分填補(bǔ)了這方面的研究空白。

關(guān)于YC-1對(duì)腫瘤中血管生成的影響，已經(jīng)證實(shí)其對(duì)乳腺癌中血管生成的抑制作用[13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VEGF與 HIF-1α mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，證明了卵巢癌細(xì)胞中的缺氧條件可使VEGF表達(dá)增強(qiáng)，從而影響組織中血管的生成及紅細(xì)胞能量代謝，卵巢癌細(xì)胞更好的適應(yīng)缺氧狀態(tài)，而YC-1能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而降低VEGF的表達(dá)，抑制血管生成，降低腫瘤的侵襲力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YC-1在體外實(shí)驗(yàn)中可以有效改善卵巢癌細(xì)胞中的缺氧狀況，抑制新生血管的生成，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性，為未來卵巢癌臨床藥物治療多樣化提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.006

InvitroReguation of YC-1 on the Chemotherapy Sensitivity of Ovarian Cancer

HUANG Jinling，HONG Li，HONG Shasha，MIN Jie，HU Ming，ZHAO Yang，YANG Qing

(DepartmentofGynecologyandObstetrics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective To investigate the contribution of hypoxia-inducible factor inhibitor YC-1 to cisplatin chemo-sensitivity to human ovarian cancer cells A2780sinvitro. Methods Ovarian cancer cells were divided into four groups which were treated with saline, YC-1, cisplatin, and YC-1 + cisplatin, separately, mRNA of HIF-1α and VEGF in the A2780s cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR by calculating 2-△△CT；the protein were detected by Western blot, to evaluate the change of hypoxia and angiogenesis capabilities under the ovarian cancer microenvironment. Results Compared with the control group, mRNA and protein of HIF-1α and VEGF expressed less in the group of YC-1, cisplatin and YC-1+cisplatin；while, those in the group of YC-1 + cisplatin were lower than the monotherapy (P<0.05), but no significant difference was detected between the YC-1 and cisplatin groups, and the expression of HIF-1 α and VEGF mRNA were positively related(r=0.830 5)in each group. Conclusion YC-1 exerts the antitumor effect and may contribute to sensitivity to cisplatin in the therapy of ovarian cancer.

1-Benzyl-3-(5-hydroxymethylfur-2-yl)indazole；Hypoxia-inducible factor；Cancer, ovarian；Cisplatin；Chemo-resistance

2014-06-25

2014-07-22

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010CDB06903)

黃金玲(1983-)，女，吉林吉林人，主治醫(yī)師，在讀博士，研究方向：婦科腫瘤。電話：027-88041911-82128，E-mail：sherryjinling@foxmail.com。

洪莉(1970-)，女，湖北武漢人，主任醫(yī)師，博士，研究方向：婦科腫瘤和盆底功能障礙性疾病。E-mail：drhongli1011@yeah.net。

R737.31；R965

A

1004-0781(2015)07-0871-05