番茄紅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

寧靜，張松，張余杭

(鄭州市第九人民醫(yī)院1.老年二科；2.眼科；3.病理科，鄭州 450053)

番茄紅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

寧靜1，張松2，張余杭3

(鄭州市第九人民醫(yī)院1.老年二科；2.眼科；3.病理科，鄭州 450053)

目的 研究番茄紅素對香煙煙霧提取物致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法 將人臍周靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分為4組，對照組不做任何處理，其余3組分別使用10% 香煙煙霧提取物(CSE)、10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素及1.0 μmol·L-1番茄紅素處理。MTT法分析各組細(xì)胞增殖情況，活性氧簇(ROS)檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期和凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot技術(shù)分析各組細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)表達(dá)水平。結(jié)果 10%CSE組、10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組、1.0 μmol·L-1番茄紅素組細(xì)胞存活率分別為(56.7±5.1)%，(75.6±7.1)%和(95.5±9.7)%。ROS檢測發(fā)現(xiàn)，對照組、10% CSE組、10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組和1.0 μmol·L-1番茄紅素組相對熒光強(qiáng)度分別為25.3±3.9，67.3±4.6，45.3±3.9，20.8±2.9。10%CSE可引起細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯，番茄紅素處理可以緩解此效果。對照組、10% CSE組、10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組和1.0 μmol·L-1番茄紅素組凋亡率分別為(6.2±0.5)%，(30.8±4.3)%，(18.3±1.9)%，(7.6±0.4)%。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，10%CSE組 SIRT1 mRNA表達(dá)是其(0.51±0.03)倍，10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組為(0.84±0.05)倍、1.0 μmol·L-1番茄紅素組為(1.31±0.08)倍。Western blot蛋白條帶分析結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。結(jié)論 番茄紅素可以減輕CSE對HUVEC的損傷作用，其機(jī)制可能與番茄紅素提高SIRT1表達(dá)有關(guān)。

番茄紅素；血管內(nèi)皮細(xì)胞，人臍周靜脈；香煙煙霧；沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1

老年人是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)常見發(fā)病人群，因?yàn)槔夏耆顺０橛懈哐獕?、血脂代謝異常、糖尿病等，這些均是AS發(fā)生的高危因素。AS可導(dǎo)致動脈管腔變窄、彈性減弱，引起血栓以及供血障礙，是心腦血管病的病理基礎(chǔ)[1]。發(fā)生于冠狀動脈的AS可引起心絞痛、猝死，嚴(yán)重威脅老年人群健康。AS發(fā)生的機(jī)制之一是血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷，VEC損傷后屏障功能減弱，通透性增高，大量脂質(zhì)在內(nèi)皮下沉積；損傷的VEC對單核細(xì)胞粘附增加，單核細(xì)胞粘附后遷入內(nèi)皮下間隙，分化為巨噬細(xì)胞，攝取低密度脂蛋白膽固醇，成為泡沫細(xì)胞，引發(fā)AS[2-3]。吸煙是導(dǎo)致AS的危險(xiǎn)因素，因?yàn)橄銦煙熿F可以損傷VEC，引起VEC增殖抑制，誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制之一為香煙煙霧中的大量氧化物質(zhì)能造成VEC的氧化損傷[4]。因此抗氧化可以作為防治香煙煙霧損傷的切入點(diǎn)。番茄紅素的抗氧化性已有報(bào)道[5]，但番茄紅素能否對抗香煙煙霧引起的氧化損傷筆者少見報(bào)道，其機(jī)制有待研究。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)在抑制氧化應(yīng)激、保持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[6]。筆者以人臍周靜脈VEC(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為對象，觀察番茄紅素能否減輕香煙煙霧提取物造成的VEC損傷，并觀察此過程中SIRT1的表達(dá)變化，以期揭示番茄紅素對抗香煙煙霧損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HUVEC細(xì)胞株(上海拜力生物科技有限公司)。

1.2 試劑與儀器 小牛血清(杭州天杭生物制品有限公司，批號：20130813)，達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)購自美國Gibco公司(批號：12491-015)，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(北京碧云天生物制品有限公司，批號：S0033)，90%～95%番茄紅素(批號：75051)、噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]試劑(批號：M5655)、凋亡檢測試劑盒(批號：APOAF-20TST)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，批號：P4170)均購自美國Sigma公司，RNA提取試劑盒購自美國QIAGEN公司(批號：931636)，ImProm-Ⅱ?反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：K1005S)、GO Taq?qPCR Master Mix(批號：A6001)均購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人SIRT1多克隆抗體(批號：sc-74504)、小鼠抗人β-actin多克隆抗體(批號：sc-130300)、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HPR)標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(批號：sc-2005)均購自美國SANTA CRUZ公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(批號：P1511)、超敏電化學(xué)發(fā)光液(super electrochemistry liquid，Super ECL)(批號：P1020)均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ELx800酶標(biāo)儀(美國biotek公司)，F(xiàn)C500MCL流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)，S1000PCR儀(美國BIO-RAD公司)，7700型熒光定量PCR分析系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。Western blot系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞消化采用0.25%胰酶，細(xì)胞匯合度70%～80%時(shí)傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)的制備與番茄紅素的配制 參考YOON LEE等方法并根據(jù)實(shí)際情況改進(jìn)，搭建CSE采集系統(tǒng)，10 mL注射器反復(fù)抽吸3支去過濾嘴香煙產(chǎn)生的煙霧，并將所有煙霧溶于20 mL無血清DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整pH為7.5，以滅菌后的孔徑0.22 μm過濾器除去細(xì)菌和大顆粒雜質(zhì)。以此溶液作為100%CSE原液，10%CSE在此基礎(chǔ)上使用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋，所制備的CSE需在0.5 h內(nèi)使用。番茄紅素溶解于四氫呋喃，制備成10 mmol·L-1母液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋10 000倍，制備成1.0 μmol·L-1工作液。

1.4 MTT分析 取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為4組：對照組，不做任何處理；10%CSE組，僅用10%CSE處理細(xì)胞；10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組，同時(shí)使用10%CSE和1.0 μmol·L-1番茄紅素處理細(xì)胞；1.0 μmol·L-1番茄紅素組，僅用1.0 μmol·L-1番茄紅素處理細(xì)胞。各組設(shè)5個(gè)平行孔，并設(shè)置空白調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入MTT15 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去上清液，二甲亞砜150 μL充分溶解孔底藍(lán)紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定波長490 nm處吸光度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測 細(xì)胞分組和處理同“1.4”項(xiàng)，用各濃度CSE處理細(xì)胞24 h后，小心吸取培養(yǎng)液，消化細(xì)胞，將細(xì)胞重懸浮于含有終濃度為1.0 μmol·L-12'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針無血清培養(yǎng)液?；靹蚝蠓湃肱囵B(yǎng)箱避光孵育0.5 h。隨后800 r·min-1(r=11 cm)離心5 min，去除上清液，使用無血清培養(yǎng)液小心反復(fù)洗滌、離心3次，洗去殘留探針。最終用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)2 mL重新懸浮細(xì)胞，確保細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，使用熒光酶標(biāo)儀上機(jī)測量各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞分組和處理如“1.4”項(xiàng)，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的冰PBS洗滌細(xì)胞，然后使用70%預(yù)冷乙醇，4 ℃固定12 h。使用PBS再次洗滌細(xì)胞，加入50 μg·mL-1PI 500 μL，4 ℃避光染色30 min。隨后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡分析 細(xì)胞分組和處理同“1.4”項(xiàng)。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，使用預(yù)冷冰PBS洗滌細(xì)胞，離心后使用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒緩沖液500 μL重懸浮細(xì)胞。依次加入Annexin V 5 μL以及PI10 μL，常溫避光靜置10 min后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SIRT1的mRNA表達(dá) 細(xì)胞分組和處理同“1.4”項(xiàng)。使用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞RNA。使用ImProm-II?反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取出的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒提供的說明書。使用GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒對上述合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和方案參照試劑盒說明書。SIRT1上游引物為5′-GTATTTATGCTCGCCTTGCTG -3′，下游引物為5′-TGACAGAGATGGCTGGAAT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3′，下游引物為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3′。使用2-△△CT法分析各樣本SIRT1mRNA相對表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blot 檢測SIRT1蛋白表達(dá) 使用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA蛋白裂解液(每孔500 μL)裂解細(xì)胞10 min，4 ℃12 000×g離心，取上清液。使用BCA蛋白定量分析盒，按說明書確定每孔蛋白的濃度。將總蛋白樣本與5倍濃縮(5×)緩沖液混勻，煮沸5 min后上樣，每孔上樣量保證為30 μg。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓110 V，時(shí)間1.5 h。隨后在冰浴中轉(zhuǎn)膜，使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒流250 mA，時(shí)間1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用小鼠抗人SIRT1多克隆抗體(1：500)，小鼠抗人β-actin多克隆抗體(1：1 500)4 ℃孵育12 h。接著使用磷酸鹽-聚山梨酯-20緩沖液(phosphate-tween-20 buffer，PBST)洗滌3次，除去未結(jié)合的一抗。使用HPR標(biāo)記的二抗避光孵育膜2 h。用超敏電化學(xué)發(fā)光液(super electrochemistry liquid，Super ECL)發(fā)光試劑盒處理膜條，曝光顯影后分析蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況 見圖1。10% CSE處理HUVEC細(xì)胞后，細(xì)胞增殖被明顯抑制，細(xì)胞存活率降至(56.7±5.1)%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示10%CSE可以抑制細(xì)胞增殖。10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞存活率(75.6±7.1)%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但該存活率明顯高于10%CSE處理組(P<0.05)，提示1.0 μmol·L-1番茄紅素可以削弱CSE增殖抑制作用。1.0 μmol·L-1番茄紅素處理組細(xì)胞存活率(95.5±7.8)%，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與對照組比較，*1P<0.05；與10%CSE組比較，*2P<0.05

圖1 4組細(xì)胞存活率

Compared with control group，*1P<0.05；compared with 10% CSE group，*2P<0.05

Fig.1 Cell survival rates of 4 groups of cells

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平 裝載ROS檢測試劑盒中的DCFH-DA探針后，對照組相對熒光強(qiáng)度(25.3±3.9)，10%CSE組相對熒光強(qiáng)度(67.3±4.6)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示10%CSE處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組相對熒光強(qiáng)度為(45.3±3.9)，與對照組和10%CSE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1番茄紅素組相對熒光強(qiáng)度為(20.8±2.9)，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

與對照組比較，*1P<0.05；與10%CSE組比較，*2P<0.05

圖2 4組細(xì)胞ROS水平

Compared with control group，*1P<0.05；compared with 10% CSE group，*2P<0.05

Fig.2 ROS levels of 4 groups of cells

2.3 CSE可以引起細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯，番茄紅素可以減輕該效果 見圖3。流式細(xì)胞儀分析可見對照組G1/G0百分比為(72.0±6.3)%，G2/M期的百分比為(10.5±2.1)%。；10%CSE組G1/G0百分比為(53.1±7.2)%，G2/M期百分比為(27.5±1.6)%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示10%CSE處理導(dǎo)致細(xì)胞G2期阻滯。10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組G1/G0百分比為(65.0±3.3)%，G2/M期百分比為(17.5±3.1)%。與對照組和10%CSE組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1番茄紅素組G1/G0百分比為(70.5±3.5)%，G2/M期百分比為(9.3±3.6)%，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 CSE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，番茄紅素減輕該效果 見圖4。流式細(xì)胞儀分析后獲得各組散點(diǎn)圖，以右上象限+右下象限所占比例作為細(xì)胞凋亡率。10%CSE處理組凋亡率(30.8±4.3)%，對照組凋亡率(6.2±0.5)%，10%CSE處理組明顯高于對照組(P<0.05)，提示CSE處理可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組凋亡率(18.3±1.9)%，與對照組和10%CSE組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示對于CSE處理的HUVEC，番茄紅素有抗凋亡作用。單純番茄紅素處組細(xì)胞凋亡率為(7.6±0.4)%，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 流式細(xì)胞儀分析4組細(xì)胞的細(xì)胞周期

圖4 流式細(xì)胞儀分析4組細(xì)胞凋亡率

2.5 CSE處理后SIRT1表達(dá)水平降低，番茄紅素可以提高SIRT1表達(dá) 見圖5。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，10%CSE處理后，SIRT1 mRNA表達(dá)顯著下降，相對表達(dá)水平為(0.51±0.03)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)下降，相對表達(dá)水平為(0.84±0.05)，與對照組和10%CSE組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1番茄紅素組SIRT1mRNA表達(dá)增高，與對照組比較，增高了(1.31±0.08)倍(P<0.05)。Western blot分析結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，10%CSE組細(xì)胞SIRT1蛋白水平降低，10%CSE+1.0 μmol·L-1番茄紅素組SIRT1與對照組比較，亦有所降低，但顯著高于10%CSE組，蛋白條帶灰度值分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1番茄紅素組SIRT1蛋白表達(dá)增高(圖6)。上述結(jié)果提示番茄紅素對HUVEC的保護(hù)作用可能通過提高SIRT1蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

3 討論

香煙煙霧中含有大量自由基之類的強(qiáng)氧化劑，這些物質(zhì)進(jìn)入人體后，通過復(fù)雜的反應(yīng)生成ROS，包括過氧化氫、超氧陰離子等。這些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[8]。氧化應(yīng)激損傷范圍廣泛，能夠?qū)Φ鞍住⑻?、脂質(zhì)、核酸造成損傷，從多個(gè)通路途經(jīng)引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙，其中較為嚴(yán)重的損傷是影響細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，使用10%CSE處理HUVEC，細(xì)胞增殖受到抑制，發(fā)生G2期阻滯，同時(shí)凋亡顯著增多。證實(shí)CSE確實(shí)能夠造成血管內(nèi)皮損傷，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測證實(shí)，CSE可能通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷VEC。VEC的損傷是AS發(fā)生初期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大量研究表明，AS發(fā)生過程中如脂質(zhì)斑塊的形成等環(huán)節(jié)均存在VEC的凋亡。VEC凋亡或因增殖障礙不能及時(shí)更新，會導(dǎo)致其屏障功能喪失，脂質(zhì)異常滲入，還可引起血小板黏附聚集，導(dǎo)致血栓形成，同時(shí)還會造成單核細(xì)胞浸潤，進(jìn)而形成大量泡沫細(xì)胞[11]。因此使用抗氧化藥物抵抗氧化損傷是預(yù)防AS的重要切入點(diǎn)，尤其對于有長期吸煙史的老年人更為重要。

與對照組比較，*1P<0.05；與10%CSE組比較，*2P<0.05

圖5 4組細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)水平

Compared with control group，*1P<0.05.compared with 10% CSE group，*2P<0.05

Fig.5 mRNA expression of SIRT1 in four groups of cells

番茄紅素是一種不飽和類胡蘿卜素，主要存在與茄科植物如西紅柿中，是天然的、具有清除自由基、消除單線氧態(tài)能力的抗氧化劑。研究證實(shí)番茄紅素能夠通過抗氧化作用保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，緩解缺血-再灌注損傷，并且具有一定的抗癌作用[5，12]。 本研究使用番茄紅素處理HUVEC后，明顯緩解CSE造成的損傷效果，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提示番茄紅素能夠抑制CSE造成的氧化損傷。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，CSE處理能夠降低SIRT1表達(dá)水平，而番茄紅素能夠從一定程度上提高SIRT1表達(dá)。SIRT1具有去乙酰酶活性，與心血管疾病中的關(guān)系較緊密，它主要通過調(diào)節(jié)乙酰化/去乙?；胶鈦碚{(diào)控組蛋白及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而維持與凋亡、氧化相關(guān)的一系列蛋白的活性[13]。如SIRT1可以通過FOXO通路抑制細(xì)胞凋亡、通過AMPK通路減少ROS水平，當(dāng)然AS中存在SIRT1的低表達(dá)也已被證實(shí)[14-15]。這些機(jī)制能夠解釋本研究中CSE處理后，HUVEC的SIRT1表達(dá)降低。同時(shí)本研究結(jié)果也提示番茄紅素的抗氧化作用的其中一個(gè)機(jī)制是提高SIRT1表達(dá)?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠緩解CSE造成的VEC損傷，其機(jī)制與SIRT1的表達(dá)有關(guān)。

與對照組比較，*1P<0.05；與10%CSE組比較，*2P<0.05；A.蛋白條帶；B.SIRT1條帶相對于β-actin條帶的灰度值

圖6 4組細(xì)胞SIRT1 蛋白表達(dá)水平

Compared with control group，*1P<0.05.compared with 10% CSE group，*2P<0.05.A.protein bands in western blot.B.band indensity(SIRT1/β-actin)

Fig.6 Potein expression of SIRT1 in 4 groups of cells

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.004

Protection of Lycopene Against the Injury of Vascular Endothelial Cells

NING Jing1， ZHANG Song2， ZHANG Yuhang3

(1.TheSecondDepartmentofGeriatrics；2.DepartmentofOphthalmology；3.DepartmentofPathology，the9thPeople’sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450053，China)

Objective To study the protective effect of lycopene on vascular endothelial cell injury by cigarette smoke extract (CSE). Methods CSE was prepared and the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were assigned into four groups, cells in control were untreated，and cells in other three groups were treated by 10%CSE, 10%CSE+1.0 μmol·L-1lycopene and 1.0 μmol·L-1lycopene, respectively.Cell viability was evaluated using MTT assay.The intracelluar reactive oxygen species (ROS) level was detected by ROS assay kits.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.SIRT1 expression was detected by real-time fluorescence quantification PCR (qRT-PCR) and Western blot. Results Cell viability in 10%CSE group, 10%CSE+1.0 μmol·L-1lycopene or 1.0 μmol·L-1lycopene group was (56.7±5.1)%，(75.6±7.1)% and (95.5±9.7)%, respectively.ROS assay showed that the relative fluorescence intensity in the control was 25.3±3.9, however, in 10%CSE group, 10%CSE+1.0 μmol·L-1lycopene group or 1.0 μmol·L-1lycopene group were 67.3±4.6, 45.3±3.9 and 20.8±2.9, respectively.10%CSE could induce G2arrested and which could be antagonized by 1.0 μmol·L-1lycopene.The apoptosis rate in the control, 10%CSE group, 10%CSE+1.0 μmol·L-1lycopene group or 1.0 μmol·L-1lycopene group was (6.2±0.5)%, (30.8±4.3)%, (18.3±1.9)% and (7.6±0.4)%, respectively.As shown in qRT-PCT testing, compared with the control, mRNA of SIRT1 in 10%CSE group, 10%CSE+1.0 μmol·L-1lycopene group and 1.0 μmol·L-1lycopene group was (0.51±0.03) fold, (0.84±0.05) fold, and (1.31±0.08) fold compared to the control, the data from western blot were consistent with qRT-PCR results. Conclusion Lycopene can prevent HUVECs from injury induced by CSE by upregulation of SIRT1.

Lycopene；Vascular endothelial cell, human umbilicalvien；Cigarette smoke；Silent information regulator 1

2014-05-27

2014-06-20

寧靜(1974-)，女，河南鄭州人，副主任醫(yī)師，學(xué)士，主要研究方向：老年病及心腦血管疾病。E-mail：zhengzhou9yningj@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0860-06