蛇床子素對神經(jīng)干細胞體外分化的影響*

李少恒，胡昱，姚瓔珈，教亞男，孔亮，楊青平，陶震宇，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學研究生院，大連 116600)

蛇床子素對神經(jīng)干細胞體外分化的影響*

李少恒，胡昱，姚瓔珈，教亞男，孔亮，楊青平，陶震宇，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學研究生院，大連 116600)

目的 探討蛇床子素(Ost)對神經(jīng)干細胞(NSCs)分化的影響及機制。方法 體外分離并培養(yǎng)新生小鼠腦源NSCs，免疫細胞化學法鑒定；取第5代NSCs置于含不同濃度(0，10，50，100 μmol·L-1)Ost的分化培養(yǎng)液中，免疫熒光細胞化學法檢測NSCs分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞情況；RT-PCR檢測Notch 1基因及其靶基因Mash 1和Neurogenin 2(Ngn2)表達情況。結(jié)果 免疫熒光細胞化學法顯示神經(jīng)球顯Nestin/Sox2陽性，即所培養(yǎng)的細胞為NSCs；Ost可促進NSCs更多地向神經(jīng)元(P<0.01)和少突膠質(zhì)細胞(P<0.05)分化，而非星形膠質(zhì)細胞。Ost可減少Notch 1(P<0.01)并增加Ngn 2(P<0.01)mRNA表達，其中以Ost 100 μmol·L-1組最明顯。結(jié)論 Ost可促使NSCs更多地向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化，其機制可能與Ost抑制Notch信號通路有關。

蛇床子素；神經(jīng)干細胞；分化；Notch信號通路

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1]。隨著技術(shù)的發(fā)展，NSCs移植治療中樞退行性疾病受到研究者關注，其中最基礎的是NSCs在體外的增殖和分化。蛇床子素(osthole，Ost)是從傘形科植物獨活和蛇床子等中提取分離出來的香豆素類化合物[2-3]。研究證明，Ost具有抗腫瘤[4]、抗肝炎[5]和抗炎[6]等多種藥理活性。明磊國等[7]發(fā)現(xiàn)Ost對骨髓基質(zhì)干細胞成骨性分化有一定影響，但對NSCs的分化是否有影響筆者較少見到報道。筆者在本實驗中給予NSCs不同濃度Ost，觀察NSCs分化情況，觀察Ost對NSCs分化的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級昆明種小鼠，購于大連醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)：2008-0002。孕鼠飼養(yǎng)環(huán)境為每籠1只，室溫(23±2) ℃，給予自來水以及鼠糧(遼寧長生生物技術(shù)有限公司)，光照與黑暗時間比例為7：5，待生產(chǎn)后取新生48 h內(nèi)小鼠用于實驗。

1.2 試藥 Ost(7-methoxy-8-isopentenoxycoumarin，C15H16O3)購于中國食品藥品檢定研究院(批號：110822-200705)，溶于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司，批號：302A035)，終濃度<0.01%，用DMEM/F12(Dulbecco's modified eagle medium：nutrient mixture F-12 ，Gibco公司，批號：8114303)培養(yǎng)液配成各濃度待用。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco公司)，青-鏈霉素(penicillin-streptomycin，P/S，Thermo公司，批號：J140031)，一抗分別為巢蛋白(Nestin，Millipore公司)、Sox2(Invitrogen公司)、神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei ，NeuN)一抗(Millipore公司)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，北京博奧森生物公司)、NG2(Upstate公司)；二抗分別為Cy3標記羊抗小鼠IgG(Jackson公司)、Cy3標記驢抗兔IgG(Jackson公司)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記驢抗兔IgG(Jackson公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液(Sigma公司)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Thermo公司)，PCR Master Mix Kit試劑盒(Thermo公司)。

1.3 儀器 倒置熒光生物顯微鏡(NIB-100F，寧波永新光學股份有限公司)，超低溫冰箱(DIV-86L386，青島海爾股份有限公司)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(BPN，NUAIRE)， PCR儀(MG96G，杭州朗基科學儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius，UVP，上海天能科技有限公司)。

1.4 NSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 取新生(48 h內(nèi))小鼠大腦并分離海馬和側(cè)腦室下區(qū)，剪碎并用0.05%胰蛋白酶于37 ℃消化15 min，終止消化后經(jīng)篩網(wǎng)過濾，得到細胞懸液。細胞懸液以5×106個·mL-1接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被過的24孔板中，加入含有20 ng·mL-1表皮生長因大(epidermal growth factor,EGF)、20 ng·mL-1堿性成纖維細胞生長固(basic fibroblast growth factor,bFGF)、2%B27和1%P/S的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2-95% 空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d換液一次，7 d后取出細胞球，機械吹打為單細胞進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于以下實驗。取第5代神經(jīng)球打散為單細胞，用抗小鼠Nestin抗體和Sox2抗體進行免疫熒光細胞化學染色，顯微鏡下進行檢測鑒定[8-9]。

1.5 免疫熒光細胞化學法檢測NSCs分化能力 將第5代NSCs以5×106個·mL-1的密度置于96孔板含有不同濃度(0，10，50，100 μmol·L-1)Ost的DMEM/F12完全分化培養(yǎng)液(含有10% FBS和1% P/S 的DMEM/F12培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，每孔100 μL，并相應分為對照組(control組)、Ost 10 μmol·L-1組、Ost 50 μmol·L-1組、Ost 100 μmol·L-1組[10]。7 d后，用免疫熒光細胞化學染色法鑒定分化細胞中神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的特異性蛋白表達[11]，重復3次。

1.6 RT-PCR檢測Notch及其靶基因表達 將對照組、Ost 10 μmol·L-1組、Ost 50 μmol·L-1組、Ost 100 μmol·L-1組NSCs以5×106個·mL-1密度置于6孔板含有DMEM/F12完全分化培養(yǎng)液中，每孔4 mL。Trizol 法提取上述4組RNA，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；按照PCR Master Mix Kit 所示比例構(gòu)建PCR反應。Notch通路相關基因序列見表1。反應條件：預變性95 ℃ 2 min；變形95 ℃ 30 s，退火(Tm-5)℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。以β-actin 作為內(nèi)參。結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)分析，Image J圖像分析軟件對條帶進行吸光度掃描，結(jié)果用相對吸光度表示，相對吸光度=吸光度目的基因/吸光度β-actin，重復3次。

表1 Notch通路相關基因序列

2 結(jié)果

2.1 NSCs的培養(yǎng)與鑒定 第5代NSCs在增殖培養(yǎng)基中逐漸變大成球，經(jīng)免疫熒光細胞化學法染色神經(jīng)球呈Nestin/Sox2陽性，核藍色(圖1A、B、C)。經(jīng)過多次傳代，原代神經(jīng)球形成新的神經(jīng)球，第2～18代神經(jīng)球無顯著差異(圖1D、E)。

2.2 Ost對NSCs分化的影響 見圖2A。經(jīng)免疫熒光染色檢測，NSCs形成3種不同類型神經(jīng)細胞：神經(jīng)元(NeuN陽性)、少突膠質(zhì)細胞(NG2陽性)和星形膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)，均為紅色，核為藍色。定量分析顯示，Ost100 μmol·L-1組NeuN陽性細胞率31.9%，模型對照組17.4%(t=4.699，P<0.01)；Ost100 μmol·L-1組NG2陽性細胞率17.2%，模型對照組9.3%(t=2.841，P<0.05)(圖2B)。提示Ost可促進NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化。

2.3 Ost調(diào)節(jié)NSCs內(nèi)Notch通路相關基因的表達 見圖3。RT-PCR結(jié)果顯示，Ost 100 μmol·L-1組相對吸光度0.382，模型對照組0.822(t=4.625，P<0.01)；Ost 100 μmol·L-1組Ngn2相對吸光度0.934，模型對照組0.268(t=8.291，P<0.01)。說明Ost顯著減少Notch1 mRNA表達并且增強Ngn 2 mRNA表達，但是其對Mash mRNA的表達無顯著改變。

A.光鏡下典型神經(jīng)球；B.Nestin/Sox2 (綠色/紅色) 免疫熒光雙染神經(jīng)球；C.DAPI (藍色) 染色細胞核；D、E.光鏡下圖像顯示從第2到第18代培養(yǎng)的神經(jīng)球

圖1 免疫熒光鑒定(×40)以及傳代擴增的神經(jīng)球(×20)

A.typical neurosphere under the microscope；B.Neurosphere was immunostained with antibodies against nestin (green) and Sox2 (red)；C. Nuclei was stained by DAPI (blue)；D,E.Neurospheres at 2nd passage and 5th passage under the microscope

Fig.1 Neurospheres (×40) identified by immunofluorescence and amplifiable neurospheres after passaged(×20)

神經(jīng)干細胞分化為NeuN陽性神經(jīng)元(A)、GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞(B)和NG2陽性少突膠質(zhì)細胞(C)，DAPI染核；D.不同濃度Ost對NSCs 分化為3種細胞的百分比；與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

圖2 Ost對NSCs分化程度百分比比較

NSCs differentiated into NeuN+ neurons(A), GFAP+ astrocytes, NG2+ oligodendrocyte precursors(C), Nuclei were stained with DAPI；D.Percentages of three cells by different concentrations of Ost; Compared with the model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.2 Differentiation percentage of NSCs by Ost

3 討論

自從REYONDS等[12]從成年小鼠的紋狀體中獲得能不斷增殖的NSCs后，NSCs就受到關注[13]。由于NSCs具有自我更新及多向分化潛能，使其有可能成為治療中樞退行性疾病的一種有效手段[14]。然而，對NSCs的增殖和分化進行有效調(diào)控是需要面對的首要問題。

A.RT-PCR檢測NSCs中Notch 1，Mash 1和Ngn 2 mRNA的表達(β-actin作為內(nèi)參)；B.Image J 檢測并比較Notch 1,Math 1和Ngn 2 mRNA 的表達；與模型對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

圖3 4組細胞中Notch 1及其靶基因mRNA表達的比較

A.mRNA expressions of Notch 1 and its target genes Math 1 and Ngn 2 were assessed by RT-PCR, normalized with β-actin internal control；B.The mRNA expressions were assessed and compared by Image J；Compared with the model control group，*1P<0.01，*2P<0.05

Fig.3 Compared with the mRNA expression of Notch 1 and its target genes among four groups of cells

Notch基因由MORGAN等在果蠅中發(fā)現(xiàn)，因其部分喪失功能性突變在果蠅翅的邊緣造成缺口而得名。研究表明，動物中相鄰細胞可通過Notch受體傳遞信號，調(diào)節(jié)增殖、分化及凋亡等過程，影響器官的形成及形態(tài)的發(fā)生[15]。有證據(jù)表明細胞表面的Notch 1可被相鄰細胞表面的配體激活，經(jīng)蛋白水解后的活化形式(NICD)釋放入核內(nèi)，并與其上的CSL DNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成復合物，激活Hes等靶基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子。后者通過抑制堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-loop-helix-domain，bHLH)家族與神經(jīng)產(chǎn)生的相關基因如Mash 1、Neurogenin 2等的轉(zhuǎn)錄，體現(xiàn)“旁側(cè)抑制”，進而抑制細胞分化，維持NSCs的原始狀態(tài)[16-18]。

本實驗按照YANG等[11]介紹的方法成功培養(yǎng)NSCs，經(jīng)鑒定該細胞為實驗所需要的NSCs。在此基礎上，筆者加入不同濃度Ost來觀察其分化情況，發(fā)現(xiàn)Ost能使NSCs更多地向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化并與濃度呈正相關。為此筆者還研究了在NSCs分化過程中Ost對Notch 1及其靶基因Mash 1和Ngn 2的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ost能使Notch 1表達下降，Ngn 2表達上升，提示Ost可能通過抑制Notch信號通路來促使NSCs向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化，其作用機制有待進一步研究。

[1] OSTENFELD T，SVENDSEN C N.Recent advances in stem cell neurobiology[J].Adv Tech Stand Neurosurg，2003，28：83-89.

[2] HOULT J R，PAYA M.Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins：natural products with therapeutic potential[J].Gen Pharmacol，1996，27(4)：713-722.

[3] 馬玉明.蛇床子素的藥理進展及劑型開發(fā)[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2008，2(15)：112-114.

[4] 周俊，程維興，許永華，等.蛇床子素對肺腺癌、肺鱗癌生長抑制作用的實驗研究[J].癌變·畸變·突變，2002，14(4)：231-233.

[5] HUANG R L，CHEN C C，HUANG Y L，et al.Osthole increase glycosylation of hepatitis B surface antigen and suppresses the secretion of hepatitis B virus ofinvitro[J].Hepatology，1996，24(3)：508-515.

[6] LIU J H，ZSCHOCKE S，REININGER E， et al.Inhi-bitory effects ofAngelicapubescensf.biserrata on 5-lipoxygenase and cyclooxygenase[J].Planta Med，1998，64(6)：525-529.

[7] 明磊國，葛寶豐，陳克明，等.蛇床子素對體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞增殖與成骨性分化的影響[J].中國藥理學通報，2010，26(8)：1098-1163.

[8]YANG J，YAN Y，CIRIC B，et al.Evaluation of bone marrow- and brain-derived neural stem cells in therapy of central nervous system autoimmunity[J].Am J Pathol，2010，177(4)：1989-2001.

[9] 胡昱，郝海光，張曉丹，等.CCR5基因轉(zhuǎn)染對骨髓源神經(jīng)干細胞生物學行為的影響[J].中國細胞生物學學報，2012，34(10)：976-982.

[10] 姚瓔珈，胡昱，李少恒，等.蛇床子素可促進體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的增殖[J].中國組織工程研究，2014，18(32)：5184-5189.

[11] YANG J，JIANG Z，F(xiàn)ITZGERALD D C，et al.Adult neural stem cells expressing IL-10 confer potent immunomodulation and remyelination in experimental autoimmune encephalitis[J].J Clin Invest，2009，119(12)：3678-3691.

[12]REYNOLDS B A，WEISS S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian nervous system[J].Science，1992，255(5052)：1707-1710.

[13] GOLDMAN S.Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system[J].Nat Biotechnol，2005，23(7)：862-871.

[14] 錢曉丹，羅春霞，朱東亞.神經(jīng)干細胞移植研究進展[J].中國細胞生物學學報，2012，34(3)：212-217.

[15] ARTAVANIS-TSAKONAS S，RAND M D，LAKE R J.Notch signaling：cell fate control and signal integration in development[J].Science，1999，284(5415)：770-776.

[16] ROSS D A，KADESCH T.Consequences of Notch-mediated induction of Jagged1[J].Exp Cell Res，2004，296(2)：173-182.

[17] OHTSUKA T，ISHIBASHI M，QADWOHL G，et al.Hesl and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation[J].EMBO J，1999，18(4)：2196-2207.

[18] ZHOU S，F(xiàn)UJIMURO M，HSIEH J J，et al.SKIP，a CBF1-assoeiated protein，interacts with the ankyrin repeat domain of NotchIC to facilitate NotchIC function[J].Mol Cell Biol，2000，20(7)：2400-2410.

DOI 10.3870/yydb.2015.07.003

Effects of Osthole on Differentiation of Neural Stem Cellsinvitro

LI Shaoheng，HU Yu，YAO Yingjia，JIAO Yanan，KONG Liang，YANG Qingping，TAO Zhenyu，YANG Jingxian

(GraduateSchool,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective To investigate the effects of osthole on neural stem cells (NSCs) differentiation and explore the potential mechanism. Methods Brain-derived NSCs from newborn mice were isolated and culturedinvitroand determined by immunofluorescence.The P5 generations of NSCs were placed in culture solution with osthole at concentrations of (0,10,50,100 μmol·L-1).The neuron, astrocyte and oligodendroglia cell differentiation were determined by immunofluorescence.The mRNA expression of Notch 1 and its target genes Mash 1 and Neurogenin 2 were assessed by RT-PCR. Results The neurosphere displayed Nestin and Sox 2-postive by immunofluorescence, suggesting that the cultured cells were NSCs.Osthole promoted NSCs differentiating into more neuron(P<0.01) and oligodendrocyte(P<0.05), but not astrocyte.Meanwhile, osthole significantly reduced the mRNA expression of Notch 1(P<0.01) and increased Ngn 2(P<0.01)at the dose of 100 μmol·L-1. Conclusion Osthole enhances NSCs differentiating into more neuron and oligodendrocyte via probablly inhibiting Notch signal pathway.

Osthole；Neural stem cells；Differentiation；Notch signal pathway

2014-07-05

2014-08-12

*國家自然科學基金資助項目(81173580)；國家自然科學基金國際合作交流項目(81210108050)；沈陽市科技專項資金項目(F11-264-1-42)

李少恒(1992-)，男，黑龍江鶴崗人，在讀碩士，專業(yè)方向：中藥藥理學。E-mail：lsh199242@163.com。

楊靜嫻(1963-)，女，遼寧大連人，教授，博士，從事神經(jīng)藥理學研究。電話：0411-87586009，E-mail：jingxianyang@yahoo.com。

R285.5；R965

A

1004-0781(2015)07-0856-05