菝葜提取物抑制良性前列腺增生活性部位篩選*

陳靜，彭華山，阮金蘭

(1.湖南省岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院藥劑科，岳陽(yáng) 414000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

·藥物研究·

菝葜提取物抑制良性前列腺增生活性部位篩選*

陳靜1，彭華山1，阮金蘭2

(1.湖南省岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院藥劑科，岳陽(yáng) 414000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

目的 研究菝葜提取物對(duì)良性前列腺增生(BPH)的抑制作用，并篩選其活性部位。方法 將雄性大鼠隨機(jī)分為8組，每組6只，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水部位組、大孔樹脂部位組、總提取物組。除假手術(shù)組外，其他各組均采用丙酸睪酮誘導(dǎo)去勢(shì)大鼠BPH模型，并分別灌胃給予菝葜各提取部位，連續(xù)3周。末次給藥后分離血清，檢測(cè)前列腺酸性磷酸酶(PACP)含量，稱取前列腺質(zhì)量并進(jìn)行病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)菝葜各提取部位抑制BPH活性。結(jié)果 菝葜各提取部位對(duì)大鼠BPH均有一定抑制作用，其中正丁醇部位、水部位和大孔樹脂部位能顯著抑制大鼠前列腺增生。與模型對(duì)照組比較，正丁醇組、水部位組及大孔樹脂部位組前列腺指數(shù)分別降低了52.80%，50.93%及67.70%，血清PACP含量均顯著降低。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，前列腺組織形態(tài)均有明顯改善。綜合各檢測(cè)指標(biāo)，菝葜大孔樹脂部位抑制BPH效果最佳。結(jié)論 菝葜提取物對(duì)模型大鼠BPH有一定抑制作用，其中大孔樹脂部位效果最好，提示其可能為抑制BPH的活性部位。

菝葜；活性部位；前列腺增生，良性

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)又稱前列腺肥大癥，是>50歲中老年男性最常見的疾病之一[1]。隨著生活水平的普遍提高，以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展，人類平均壽命將進(jìn)一步延長(zhǎng)，前列腺增生的發(fā)病數(shù)將持續(xù)增高，BPH也將成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的嚴(yán)重問題[2]。近年來，尋找治療BPH的藥物受到研究者們?cè)絹碓蕉嚓P(guān)注。

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金剛藤，系百合科菝葜屬植物，《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版收錄了該藥[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菝葜具有抗炎鎮(zhèn)痛、殺菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝血、降血糖及抗腫瘤等作用[4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，菝葜能夠很好地治療慢性前列腺炎[6-7]。前列腺炎癥在BPH的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常關(guān)鍵的作用，筆者采用丙酸睪酮誘導(dǎo)去勢(shì)大鼠前列腺增生，研究菝葜各提取部位對(duì)BPH的抑制作用并篩選其活性部位。

1 材料與方法

1.1 儀器 RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)，萬(wàn)分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，TG16-WS高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)有限公司)，UV-756紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 干燥菝葜根莖由湖北福人藥業(yè)股份有限公司于2010年提供，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)系張長(zhǎng)弓副教授鑒定為百合科菝葜屬植物菝葜(SmilaxchinaL.)，藥材樣本保存于天然藥物化學(xué)與資源評(píng)價(jià)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)：BQ201006。HPD100型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料有限公司，批號(hào)：20100506)；丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：1 mL：25 mg，批號(hào)：090702)；前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PACP)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20100617)；羧甲基纖維素鈉(sodium salt of carboxy methyl cellulose，CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20100126)；其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)：2004-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2004-0028。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)保持12 h：12 h光照和避光循環(huán)飼養(yǎng)，室溫控制在(25±2) ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度保持55%～75%。

1.4 菝葜各部位提取物的制備 稱取干燥菝葜根莖2 kg，粉碎至直徑約2 mm，加入50%乙醇20 L，加熱回流提取2 h，重復(fù)提取3次。合并濾液并于65 ℃減壓回收溶劑，得到浸膏約270 g。稱取浸膏120 g混懸于純化水5 L，依次用6倍水體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，萃取液及剩余的水溶液減壓回流后，真空冷凍干燥分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位。另取總提取物浸膏約100 g和HPD100型大孔樹脂1 000 g，按照文獻(xiàn)[8]方法，制備得到菝葜大孔樹脂部位。

1.5 大鼠BPH模型的建立 將雄性SD大鼠按照文獻(xiàn)[9]方法行去勢(shì)手術(shù)。新鮮水合氯醛溶液按350 mg·kg-1劑量對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，剪開陰囊中間位置皮膚，分離兩側(cè)睪丸，剪除兩側(cè)睪丸。假手術(shù)組除未剪除兩側(cè)睪丸，均進(jìn)行與去勢(shì)組相同的手術(shù)操作過程。每只大鼠連續(xù)3 d腹腔注射15萬(wàn)U青霉素，以預(yù)防感染。

經(jīng)過7 d恢復(fù)，所有大鼠進(jìn)食飲水及活動(dòng)情況等均恢復(fù)正常，即開始第一次實(shí)驗(yàn)給藥。假手術(shù)組大鼠每天頸部皮下注射橄欖油0.1 mL，去勢(shì)組大鼠每天皮下注射溶于橄欖油的丙酸睪酮注射液0.5 mg(0.1 mL)，連續(xù)注射3周，用以建立大鼠BPH模型。

1.6 分組與給藥 去勢(shì)手術(shù)后，模型大鼠按隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)分組法分為7組，每組6只：模型對(duì)照組，石油醚組，乙酸乙酯組，正丁醇組，水部位組，大孔樹脂部位組以及總提取物組。皮下注射丙酸睪酮約1 h后(其中假手術(shù)組皮下注射橄欖油)，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠每天灌服0.5% CMC-Na溶液1 mL，其余各給藥組每天灌服混懸于0.5% CMC-Na溶液的菝葜各部位提取物1 mL，劑量為根據(jù)各部位提取率換算成10 g(原生藥)·kg-1，連續(xù)灌胃3周。所有大鼠每周稱量記錄體質(zhì)量1次。末次給藥后，取血，3 000 r·min-1(r=14 cm)離心15 min，分離血清用于檢測(cè)PACP含量。分離出完整前列腺組織稱重，計(jì)算前列腺濕重指數(shù)。并用10%多聚甲醛固定用于蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色檢測(cè)前列腺組織病理形態(tài)。其中前列腺濕重指數(shù)計(jì)算公式如下：前列腺濕重指數(shù)=前列腺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×1 000。抑制率(%)=100-[(給藥組-假手術(shù)組)/(模型對(duì)照組-假手術(shù)組)]×100%。

2 結(jié)果

2.1 菝葜各部位提取物對(duì)大鼠前列腺濕重指數(shù)的影響 見表1。模型對(duì)照組大鼠前列腺濕重和前列腺濕重指數(shù)與假手術(shù)組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示大鼠去勢(shì)后注射丙酸睪酮3周，BPH造模成功，該方法可靠、重現(xiàn)性好。與模型對(duì)照組比較，各給藥組大鼠前列腺質(zhì)量及前列腺濕重指數(shù)均不同程度降低，且正丁醇組、水部位組及大孔樹脂部位組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示菝葜上述3個(gè)提取部位對(duì)BPH抑制效果較好。

2.2 病理學(xué)檢查 8組大鼠前列腺組織病理檢查結(jié)果見圖1。假手術(shù)組前列腺組織細(xì)胞未見明顯病理學(xué)變化；模型對(duì)照組前列腺上皮細(xì)胞明顯增生，上皮細(xì)胞顯著增厚，層數(shù)增加，上皮厚度明顯增高，可發(fā)現(xiàn)很多乳頭狀突起伸入腺腔，腺體管腔直徑顯著下降。經(jīng)過菝葜各部位提取物連續(xù)3周治療后，與模型對(duì)照組比較，除石油醚組和乙酸乙酯組改善較少外，其余4組前列腺組織病理結(jié)構(gòu)均有不同程度改善，如腺腔直徑變大，乳頭狀突出物減少，腺體上皮厚度均有一定程度降低，尤其是大孔樹脂部位組，乳頭狀突起物顯著減少，腺腔直徑增大，接近假手術(shù)組。

表1 8組大鼠前列腺質(zhì)量、濕重指數(shù)、抑制率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Determination results of prostate weight, wet weight index and the inhibition ratio in eight groups of rats

±s

與假手術(shù)組比較，*1P< 0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P< 0.05，*3P< 0.01

Compared with sham operation group,*1P< 0.01；Compared with model control group,*2P< 0.05，*3P< 0.01

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.石油醚組；D.乙酸乙酯組；E.正丁醇組；F.水部位組；G.大孔樹脂部位組；H.總提取物組

A.sham operation group；B.model control group；C.petroleum ether fraction group；D.acetic ether fraction group；E.n-butyl alcohol fraction group；F.water fraction group；G.macroporous resin fraction group；H.total extract group

Fig.1 Histopathologic result of prostate histopathology in eight groups of rats(HE,×100)

2.3 菝葜各部位提取物對(duì)大鼠PACP的影響 見圖2。模型對(duì)照組大鼠PACP含量較假手術(shù)組顯著上升(P<0.01)，提示模型對(duì)照組大鼠前列腺處于增生狀態(tài)。各給藥組經(jīng)過3周治療后，血清PACP含量較模型對(duì)照組均不同程度下降，且正丁醇組、水部位組以及大孔樹脂部位組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

BPH是老年男性人群多發(fā)病，其引起的尿頻、尿急、血尿等嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因此尋找安全、低毒、高效的治療藥物一直是研究人員的關(guān)注熱點(diǎn)。

菝葜具有顯著的抗炎、抗腫瘤等活性，對(duì)慢性前列腺炎也有很好的治療效果[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)菝葜不同部位提取物均顯示出一定的抑制BPH活性，其中大孔樹脂部位效果最明顯，其能顯著降低前列腺濕重及前列腺濕重指數(shù)。PACP是前列腺分泌物中能水解磷酸酯的一種糖蛋白，在前列腺炎、前列腺增生以及前列腺癌等疾病中，血清PACP水平增高[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者也發(fā)現(xiàn)，菝葜大孔樹脂部位能顯著降低血清PACP含量，并通過病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，其能顯著改善大鼠前列腺組織增生病變。

與假手術(shù)組比較，*1P< 0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01

圖2 8組大鼠血清PACP測(cè)定結(jié)果

Compared with sham operation group,*1P< 0.01;Compared with model control group,*2P< 0.01

Fig.2 Serum PACP content in eight groups of rats

對(duì)于BPH的發(fā)病機(jī)制，目前的研究還遠(yuǎn)不能詳細(xì)闡釋，但是越來越多的研究表明，凋亡和炎癥因子參與了BPH的發(fā)生發(fā)展過程[11-12]?；谳幂值目鼓[瘤及抗炎等活性，筆者推測(cè)其抑制BPH活性可能與抑制增生過程中所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)前列腺增生細(xì)胞發(fā)生凋亡等機(jī)制有關(guān)。

通過以上研究，筆者發(fā)現(xiàn)菝葜提取物對(duì)BPH大鼠模型具有較好的抑制作用，并篩選出其中治療效果最好的大孔樹脂部位。在以后的研究中，筆者將對(duì)菝葜大孔樹脂部位治療BPH的具體作用機(jī)制及其中的活性化合物等做進(jìn)一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.001

Screening for the Bioactive Fraction ofSmilaxchinaL.on Inhibition of ExperimentallyInduced Benign Prostatic Hyperplasia

CHEN Jing1, PENG Huashan1, RUAN Jinlan2

(1.DepartmentofPharmacy,theFirstPeople'sHospitalofYueyang,HunanProvince,Yueyang414000,China；2.SchoolofPharmacy,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Objective To study the effect of extracts ofSmilaxchinaL.on inhibition the experimentally induced benign prostatic hyperplasia (BPH), and screen the effective fraction. Methods The BPH model was built on the castrated rats by subcutaneous injection of testosterone propionate.Male rats were randomly divided into eight groups (n=6)：sham operation, model control, petroleum ether fraction, acetic ether fraction,n-butyl alcohol fraction, water fraction, macroporous resin fraction(FMR), and total extracts group.The rats were treated with testosterone propionate by subcutaneous injection for consecutive 3 weeks.Meanwhile, rats were orally administrated with the six extract fractions ofS.chinaL.After the last administration, serum was separated for the determination of prostatic acid phosphatase (PACP), prostate was weighed and histopathological examination was carried out to evaluate the inhibitory effect ofS.chinaL.against BPH. Results All of the six fractions fromS.chinaL.could inhibit BPH, and then-butanol fraction, water fraction and FMR showed better inhibitory effect, which significantly decreased the prostatic index by 52.80%, 50.93% and 67.70%, respectively, remarkably reduced serum PACP, and notably improved the prostate gland morphology compared with the model group.Among the three fractions, FMR showed the strongest effect against BPH. ConclusionS.chinaL.ameliorates the experimentally prostatic hyperplasia, and FMR showes the best effect, which might be the bioactive components against BPH.

SmilaxchinaL.；Bioactive fraction；Prostatic hyperplasia, benign

2014-07-15

2014-08-20

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173065)

陳靜(1987-)，男，湖南岳陽(yáng)人，主管藥師，博士，主要從事中藥活性成分研究。E-mail：jingch0829@163.com。

阮金蘭(1952-)，男，湖北當(dāng)陽(yáng)人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥生物活性物質(zhì)研究。電話：027-83692892，E-mail：jinlan8152@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0847-04