中華絨螯蟹點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

曹海鵬，溫樂(lè)夫，白金尊，張 帆，何 珊

（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206），上海201306）

中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種之一，深受消費(fèi)者的青睞。近年來(lái)，隨著中華絨螯蟹經(jīng)濟(jì)價(jià)值的日益顯現(xiàn)，中華絨螯蟹市場(chǎng)需求量不斷增加，規(guī)?；B(yǎng)殖日益擴(kuò)大，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在江蘇、安徽、湖北、浙江及北方的遼寧等主產(chǎn)地迅猛發(fā)展，年產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)了60余萬(wàn)噸，年產(chǎn)值已達(dá)400億元［1］。然而，由于養(yǎng)殖戶投飼不科學(xué)、水質(zhì)惡化等諸多因素，病害問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重，給中華絨螯蟹養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，腸炎是目前嚴(yán)重影響我國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖發(fā)展的細(xì)菌性病害之一，但從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來(lái)看，中華絨螯蟹腸炎的研究基礎(chǔ)薄弱，未見(jiàn)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起的中華絨螯蟹腸炎及其防控藥物等方面研究的詳細(xì)報(bào)道。2014年8月，江蘇省泗洪縣一養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖的中華絨螯蟹出現(xiàn)了嚴(yán)重的腸炎，每天死亡量高達(dá)180多只，主要病癥為病蟹行動(dòng)遲緩，攝食減少或不攝食；剖檢可見(jiàn)，腸道發(fā)炎，有膿狀黏液且無(wú)糞便，肝胰腺呈暗黃色。本研究從自然發(fā)病的中華絨螯蟹體內(nèi)分離鑒定病原菌，并進(jìn)一步分離鑒定菌株的分類地位與藥敏特性，以期為中華絨螯蟹腸炎的病原學(xué)研究與防控提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

患腸炎的中華絨螯蟹，12只，平均體重為62.3g，取自江蘇泗洪縣自然發(fā)病養(yǎng)殖池。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 選取具有典型發(fā)病癥狀的瀕死中華絨螯蟹，用750mL／L酒精表面消毒后常規(guī)無(wú)菌取其肝胰腺組織，分別在TCBS瓊脂平板和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，30℃恒溫培養(yǎng)18h～24h后純化分離菌株，然后轉(zhuǎn)接到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的人工回歸感染試驗(yàn) 選取無(wú)病傷、體質(zhì)健壯、大小均勻（平均體重為36.1g）的健康中華絨螯蟹進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)。試驗(yàn)共包括5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組試驗(yàn)中華絨螯蟹各10只。用無(wú)菌生理鹽水分別洗下培養(yǎng)基斜面上各分離菌株的菌苔，用稀釋涂布平板法測(cè)定并調(diào)節(jié)各菌懸液濃度為1.0×107CFU／mL，然后分別在健康中華絨螯蟹第3步足基部注射［2］，每尾注射0.1mL，對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。連續(xù)6d觀察中華絨螯蟹的發(fā)病癥狀及死亡情況，發(fā)現(xiàn)死蟹及時(shí)撈出，解剖檢查其病變情況，同時(shí)對(duì)回歸感染發(fā)病瀕死的中華絨螯蟹肝胰腺組織進(jìn)行常規(guī)病原菌再分離。每組試驗(yàn)中華絨螯蟹各10只，水溫控制在為28℃。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 生理生化鑒定 參照余銀春等［3］方法，用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.3.2 分子鑒定 以病原菌株的基因組DNA為模板，對(duì)其16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，正向引物為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR的擴(kuò)增條件為：94 ℃3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測(cè)得序列用DNA Man軟件編輯后，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中利用BLASTN軟件與Gen-Bank基因庫(kù)中已知的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性較高的序列并利用軟件BioEdit 7.0和MEGA 4.0進(jìn)行多重比較后通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 病原菌藥敏特性的測(cè)定 參照KB紙片擴(kuò)散法［4］進(jìn)行，并根據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：第19版信息增刊》，判定病原菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。其中，藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離

結(jié)果見(jiàn)表1。從自然發(fā)病的中華絨螯蟹的肝胰腺中分離純化到5株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)，證實(shí)菌株DD5對(duì)中華絨螯蟹有致病作用，人工感染中華絨螯蟹的發(fā)病與死亡癥狀與自然病癥基本相同，而且從人工感染的中華絨螯蟹的肝胰腺內(nèi)又可分離到與原菌株形態(tài)特征、理化性質(zhì)一致的菌株，表明菌株DD5是引起該病的病原菌。

2.2 病原菌的鑒定

結(jié)果見(jiàn)表2。API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株DD5的生化鑒定結(jié)果表明，菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonaspunctata），鑒定結(jié)果的可信度為99.9%。此外，通過(guò)對(duì)菌株DD5的16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1400bp大小的片段，其在Gen-Bank上的登錄號(hào)為：KP260655。通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的BLASTN軟件對(duì)菌株DD5的16SrDNA序列與基因庫(kù)中已知菌株的16SrDNA序列進(jìn)行了同源性比較。結(jié)果表明，菌株DD5的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中氣單胞菌屬菌株的16SrDNA序列有99%～100%的同源性。通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株DD5 16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）進(jìn)一步可以看出，菌株DD5與點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌136c株（GenBank登錄號(hào)：EU488688）的親緣關(guān)系最近。結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化鑒定及16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，判定菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌。

表1 分離菌株對(duì)中華絨螯蟹人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of artificial infection test of bacterial isolates Eriocheir sinensis

表2 菌株DD5的生化特征性鑒定Table 2 Identification of biochemical characteristics of strain DD5

2.3 病原菌的藥敏特性

結(jié)果見(jiàn)表3。菌株DD5對(duì)12種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DD5對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、復(fù)方新諾明等8種抗生素高度敏感，對(duì)多黏菌素中度敏感，對(duì)氨芐西林、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素等3種抗生素耐藥。

圖1 通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株DD5及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of strain DD5and other related strains by neighbor-joining method

表3 菌株DD5的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of strain DD5

3 討論

點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要病原菌之一［5］，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有極強(qiáng)的致病能力［6］，可引起中華鱉（Trionyxsinensis）、鯽魚(yú)（Carassiusauratus）、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、草魚(yú)（Ctenopharyngodonidllus）、縊 蟶（Sinvnovaculaconstricta）等海水、淡水養(yǎng)殖動(dòng)物出現(xiàn)大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來(lái)看，未見(jiàn)到點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起中華絨螯蟹腸炎的研究報(bào)道。本試驗(yàn)證實(shí)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌對(duì)中華絨螯蟹具有致病性，并分析了其生理生化特性與藥敏特性，再一次表明了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的廣泛危害性，也進(jìn)一步豐富了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌的病原學(xué)研究資料。

腸炎是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見(jiàn)的細(xì)菌性病害之一，病死率一般為30%～60%，嚴(yán)重的可達(dá)95%以上，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失［7］。本試驗(yàn)證實(shí)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌是中華絨螯蟹腸炎的病原菌，能夠?qū)е轮腥A絨螯蟹出現(xiàn)大量死亡。點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起中華絨螯蟹腸炎的發(fā)病機(jī)理，可能是由于點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌在腸道內(nèi)大量生長(zhǎng)增殖后侵入腸壁血管，通過(guò)血液循環(huán)遍布至肝胰腺，同時(shí)產(chǎn)生毒力因子，導(dǎo)致肝胰腺和腸道出現(xiàn)病變，引起中華絨螯蟹死亡。當(dāng)然，除了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌本身因素外，該病的發(fā)生可能與養(yǎng)殖戶投喂變質(zhì)飼料或不正常投飼也有較大的關(guān)系。

生理生化鑒定是細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)之一［8-9］。然而，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株DD5對(duì)鳥(niǎo)氨酸、肌醇等指標(biāo)的生理生化反應(yīng)與溫海深等［10］報(bào)道的鯽源分離株不同，對(duì)檸檬酸鹽、肌醇等指標(biāo)的生理生化反應(yīng)與李軍等［11］報(bào)道的草魚(yú)源分離株不同。這可能與來(lái)源于不同地區(qū)、養(yǎng)殖動(dòng)物的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌菌株在地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等方面存在差異有關(guān)。因此，為了準(zhǔn)確鑒定菌株DD5，本試驗(yàn)進(jìn)一步采用了16SrDNA序列分析對(duì)菌株DD5的分類地位進(jìn)行分析，以彌補(bǔ)生理生化鑒定的不足，最終證實(shí)了菌株DD5的16SrDNA序列分析結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致，確定菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌。

水生環(huán)境殘留的抗生素對(duì)細(xì)菌耐藥性的誘導(dǎo)產(chǎn)生、耐藥基因水平擴(kuò)散和垂直傳播具有重要的作用，造成養(yǎng)殖水環(huán)境及動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的增強(qiáng)、養(yǎng)殖動(dòng)物抗病能力降低、抗菌藥物在體內(nèi)積聚而殘留量增大等不良影響，進(jìn)而通過(guò)食物鏈傳遞到人體內(nèi)，對(duì)消費(fèi)者身體健康產(chǎn)生了潛在威脅［12］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌菌株DD5對(duì)鏈霉素、慶大霉素、恩諾沙星等多種水產(chǎn)常用抗菌藥物均未產(chǎn)生耐藥性，說(shuō)明養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有濫用抗菌藥物，驗(yàn)證了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中養(yǎng)殖戶反映沒(méi)有濫用抗菌藥物的說(shuō)法，這也為該病的合理用藥防控提供了科學(xué)依據(jù)。除該病的藥物防治外，國(guó)外學(xué)者［13］也針對(duì)生物防治進(jìn)行了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌噬菌體的分離，為該病生物控制技術(shù)的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］王成輝.中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)成效顯著［J］.上海農(nóng)村經(jīng)濟(jì)，2013（12）：28-30.

［2］徐海圣，舒妙安，占秀安，等.養(yǎng)殖河蟹病原菌分離鑒定及其胞外產(chǎn)物的致病性［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2002，26（4）：357-362.

［3］余銀春，王錫波，彭程遠(yuǎn)，等.養(yǎng)殖烏鱧皮膚潰爛病的病原及血液病理研究［J］.淡水漁業(yè)，2014，44（4）：73-76.

［4］冷 闖，鄧舜洲，張文波，等.中華鱉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（2）：124-129.

［5］Yano Y，Hamano K，Tsutsui I，et al.Occurrence，molecular characterization，and antimicrobial susceptibility ofAeromonasspp.in marine species of shrimps cultured at inland low salinity ponds［J］.Food Microbiol，2015，47：21-27.

［6］Piotrowska M，Popowska M.The prevalence of antibiotic resistance genes amongAeromonasspecies in aquatic environments［J］.Ann Microbiol，2014，64：921-934.

［7］高文軒.漁業(yè)生產(chǎn)中腸炎病的防治技術(shù)［J］.漁業(yè)致富指南，2014（14）：59-59.

［8］Shamim K，Naik M M，Pandey A，et al.Isolation and identification ofAeromonascaviaestrain KS-1as TBTC-and lead-resistant estuarine bacteria［J］.Environ Monit Assess，2013，185：5243-5249.

［9］王海娟，王 利.鱸魚(yú)豚鼠氣單胞菌的鑒定及其藥敏試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（9）：123-126.

［10］溫海深，劉振琦，馬國(guó)文.鯽腐皮病病原菌的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，10（1）：49-55.

［11］李 軍，閔正沛，徐伯亥，等.草魚(yú)腸型點(diǎn)狀氣單胞菌的分離和鑒定［J］.水利漁業(yè)，2007，27（2）：107-108.

［12］李 琴，孫成波，陳美領(lǐng)，等.湛江東海島對(duì)蝦育苗場(chǎng)水體細(xì)菌的抗生素耐藥性［J］.熱帶生物學(xué)報(bào)，2014，5（1）：8-14.

［13］Haq I U，Chaudhry W N，Andleeb S，et al.Isolation and partial characterization of a virulent bacteriophage IHQ1specific forAeromonaspunctatafrom stream water［J］.Microb Ecol，2012，63：954-963.