四個豌豆品系的根瘤結(jié)構(gòu)觀察及土壤微生物分布研究

劉慎思

摘 要 實驗以w-13、w-15、w-17，zyz-4892等四個豌豆品系為觀察對象，用石蠟切片發(fā)和平板培養(yǎng)法觀察豌豆的根瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)和根際微生物群落。結(jié)果表明，豌豆品系w-17與本地土著根瘤菌適應(yīng)性最好，其次是w-15，而zyz-4892與w-15不適應(yīng)本地根瘤菌。在土壤微生物培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，根瘤數(shù)量可能與根際細菌數(shù)量成正線性相關(guān)，而土壤根際放線菌的數(shù)量，結(jié)瘤明顯的w-13和w-17品系是結(jié)瘤不明顯品系w-15和zyz-4892的9倍。

關(guān)鍵詞 豌豆；根瘤結(jié)構(gòu)；根際微生物

中圖分類號：S643.3；S154.3 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）12-001-02

豌豆（Pisum sativum）是繼大豆之后的第二大食用豆類作物[1]，富含碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維以及維生素B1、維生素B2、維生素C等。豌豆具有根瘤固氮的特性，種植豌豆可以用地養(yǎng)地結(jié)合，糧、菜、飼兼用，豌豆作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然氮素平衡中發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用生物固氮能有效減少氮肥的使用，對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展有至關(guān)重要的戰(zhàn)略意義。

大量研究表明，在高產(chǎn)豌豆種植技術(shù)中，人工根瘤菌接種是提升豌豆產(chǎn)量的有效途徑。但是有些研究指出，在實際農(nóng)業(yè)種植中接種根瘤菌的增產(chǎn)效果有時并不明顯，這可能是因為土壤中有大量的競爭能力強但固氮效率低的土著菌群，它們對接種的根瘤菌競爭結(jié)瘤的能力產(chǎn)生了干擾和削弱。接種根瘤菌是否成功，大部分來自于接種的菌株的結(jié)瘤競爭能力，而結(jié)瘤率是測量競爭結(jié)瘤能力的重要指標(biāo)。本實驗選取四個豌豆品系，以豌豆的根瘤和根際微生物為研究對象，用石蠟切片法、平板梯度稀釋法研究豌豆根瘤結(jié)構(gòu)和豌豆根際微生物群落的分布，分析影響豌豆結(jié)瘤的因素，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中人工接種根瘤菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試豌豆品系

處在開花時期的豌豆品系w-13、w-15、w-17，zyz-4892。四個豌豆品系的根瘤均來自湖北豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心永安基地。采集時，觀察根瘤的形態(tài)及著生位置，經(jīng)清洗后及時固定于FAA液中。

1.2 實驗方法

根瘤結(jié)構(gòu)觀察用石蠟切片法；微生物的數(shù)量測定采用平板梯度稀釋法。其中細菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)基為高氏1 號瓊脂培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 四個豌豆品系的根系形態(tài)及結(jié)瘤情況比較分析

從圖1可以看出，在4個豌豆品系中，w-13的側(cè)根數(shù)目最多，側(cè)根密度最大，其次是zyz-4892；w-17上可以看到其水平生長優(yōu)勢明顯，二級側(cè)根數(shù)量較多，且有較長的側(cè)根分枝；zyz-4892的側(cè)根細長，側(cè)根上分枝稀疏，根表皮顏色較其它3個品系淺；w-15在4個品系中的主根最發(fā)達，側(cè)根較粗，但側(cè)根數(shù)量最少，側(cè)根的分枝密度與zyz-4892程度相似。4個豌豆品系中僅有w-13和w-17有一定數(shù)量的根瘤，且有10 mm以上根瘤形成，最大的達到20 mm；zyz-4892只有少量幾個根瘤形成，與w-13和w-17上形成的較小的根瘤相似，大小多為2～4 mm；在w-15上并沒有找到明顯的根瘤狀組織。所有根瘤形成的位置都在較細的側(cè)根上。根瘤的形狀、顏色、大小隨品系的不同差異并不明顯，根瘤的形狀均為長棗狀、姜狀或珊瑚狀；根瘤的顏色為乳白色、淺黃色、淺褐色或者褐色。

2.2 不同豌豆品系根瘤結(jié)構(gòu)觀察

從橫切面（圖2）觀察可以看到，被染成深紅色的中心含菌細胞區(qū)和染色較淺的外皮層。在發(fā)現(xiàn)根瘤的3個豌豆品系中，在皮層細胞的細胞壁位置可以有看到有染成紅色的根瘤菌，其中以w-13的最為明顯；含菌細胞區(qū)是根瘤固氮的主要位置，在3個豌豆品系中，w-17的含菌細胞區(qū)幾乎全被感染細菌所占滿，以染色的程度來看，w-17的感染細胞在中心位置分布均勻，而且感染率最高，由此可以看出，w-17與本地土著根瘤菌的適合度最高；從皮層與含菌細胞之間的分生組織中可以看，出本地根瘤菌在w-17中生長最旺盛。在w-13中，也可以看到，一定數(shù)量的分生組織，但含菌細胞區(qū)的細胞感染率沒有w-17的高，且感染面積沒有w-17大。zyz-4892的中心含菌區(qū)與皮層界界限不明顯，且含菌細胞區(qū)感染細胞分布稀疏，分生組織數(shù)量較少。從高倍鏡下觀察中心含菌細胞區(qū)，可以看到，染色部位多處于細胞壁位置，由皮層細胞中也可觀察到染紅的菌體分布可知根瘤菌沿著細胞間隙在內(nèi)部延生，包圍細胞后向細胞內(nèi)部侵入。

2.3 根際土壤微生物的分布

4個豌豆品系的根際土壤細菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性差異（p<0.05），數(shù)量最多的是w-13，其次依次是w-17、zyz-4892、w-15，這與根瘤數(shù)量的多少的順序相一致；w-17的根際土壤真菌數(shù)量顯著高于zyz-4892，而zyz-4892的真菌數(shù)量顯著高于w-13和w-15；在w-13和w-17的根際土壤中放線菌數(shù)量無明顯差異（p>0.05），但它們的放線菌數(shù)量均顯著高于zyz-4892和w-15（p<0.05），且數(shù)量均在zyz-4892和w-15的9倍以上（圖3）。

3 討論

在田間種植中，不同品系的豌豆結(jié)瘤差異可能與根瘤菌的宿主專一性相關(guān)，有很多不同的類型和數(shù)量的土著菌存在土壤中，它們可以最有效地利用土壤中有限的碳源，使它們在結(jié)瘤競爭中得到有力地位。從4個豌豆品系的根瘤結(jié)構(gòu)來看，w-17和w-13均有與土著固氮菌較好的適應(yīng)性，尤其以w-17適應(yīng)性最好，這應(yīng)該與土壤中的根瘤菌種類相關(guān)，以往的研究也表明，至今為止還沒發(fā)現(xiàn)能在結(jié)瘤競爭方面超過土著根瘤菌的根瘤菌[2]。

在4個豌豆品系中，根際微生物中真菌數(shù)量均較高，可能與花期時根際微生物變化有關(guān)，陳宏宇等人在大豆品系合豐25號根表面及根際微生物體系的變化中也說明大豆根際細菌在生育期數(shù)目有遞減的趨向，在成熟期根際的真菌有大批的聚集[3]。根際土壤中大量放線菌生長，可能與放線菌為腐生型菌和田間較高的肥力有關(guān)，而w-13和w-17根際防線菌數(shù)量遠高于zyz-4892和w-15，可能w-13和w-17較高的結(jié)瘤率有關(guān)，有前人研究發(fā)現(xiàn)在草本中，豆科植物的根際放線菌數(shù)目顯著高于非豆科植物[4]，即可能在同一物種內(nèi)根瘤較多的個體，根際放線菌數(shù)量多于其它個體。

根瘤菌競爭結(jié)瘤的影響因素還有很多，如土壤類型、肥沃程度、異類微生物的競爭、寄主的病蟲害和一些農(nóng)業(yè)措施。等。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物的研究呈現(xiàn)出快速發(fā)展的趨勢，尤其是醫(yī)學(xué)微生物和食品微生物學(xué)。關(guān)于根際微生物之間的相互作用有了進一步的了解，對于植物生長的促進和保護具有深遠的意義?，F(xiàn)在國內(nèi)外關(guān)于土壤根際微生物的關(guān)系的研究雖然廣泛，但還不夠完善。但在這一領(lǐng)域，一些新的技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，在根際微生物的應(yīng)用研究在不久的將來肯定會取得更大的進步。

參考文獻

[1]鄭卓杰.中國食用豆類學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：103.

[2]李阜棣，胡正嘉.微生物學(xué)[M].第5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：7.

[3]陳宏字，李曉鳴，王敬國.抗病性不同大豆品系根面及根際微生物區(qū)系的變化II.連作大豆（重茬）根面及根際微生物區(qū)系的變化[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2006，12（1）：104-108.

[4]王從彥，曹震，王磊，等.豆科植物對根際土壤微生物種群及代謝的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2013， 22（1）：85-89.

（責(zé)任編輯：劉昀）