長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織的誘導(dǎo)與其形態(tài)建成的初步研究

李虎，劉建國(guó)，龐通

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島 266071；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織的誘導(dǎo)與其形態(tài)建成的初步研究

李虎1，2，劉建國(guó)1*，龐通1

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島 266071；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

以PES液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計(jì)，開(kāi)展了長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)棕色藻株組織培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，探索了蔗糖、光強(qiáng)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)新芽形成和愈傷組織形成的影響，結(jié)果表明，固體培養(yǎng)基、IBA、6-BA處理可誘導(dǎo)該藻產(chǎn)生愈傷組織，同時(shí)固體培養(yǎng)基更利于誘導(dǎo)形成愈傷組織；顯微跟蹤觀察顯示，該藻愈傷組織與高等植物的疏松愈傷組織不同，由細(xì)絲狀細(xì)胞組成，系藻枝段中心髓部細(xì)胞脫分化形成的致密型愈傷組織；另外，愈傷枝段比新芽枝段有更高的光合和呼吸速率。

長(zhǎng)心卡帕藻；組織培養(yǎng)；愈傷組織；氧電極；光合與呼吸

1 引言

長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)屬紅藻門(mén)、真紅藻綱、杉藻目、紅翎菜科、卡帕藻屬[1]，是生產(chǎn)κ型卡拉膠的重要海藻。卡拉膠是一種安全、無(wú)毒、無(wú)副作用的食品添加劑，具有凝膠、增稠和保水特性，是布丁、奶酪、火腿、冰淇淋等食品加工行業(yè)的重要原料[2—5]；另外，卡拉膠在醫(yī)學(xué)上也有較好的應(yīng)用前景[6—8]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？ㄅ翆僭孱?lèi)由Doty等人20世紀(jì)70年代首先在菲律賓地區(qū)進(jìn)行人工栽培，隨后印度尼西亞、馬來(lái)西亞、中國(guó)、越南等國(guó)家相繼進(jìn)行卡帕藻屬海藻的人工栽培。40多年來(lái)完全依賴(lài)于無(wú)性繁殖方式進(jìn)行擴(kuò)繁，長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖導(dǎo)致了藻體生長(zhǎng)速率下降、產(chǎn)膠質(zhì)量下降、易感染附生藻、抗病能力低下，進(jìn)而造成產(chǎn)量大幅減少和市場(chǎng)價(jià)格發(fā)生劇烈波動(dòng)[9]，影響了相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。例如，2008年在我國(guó)海南栽培的長(zhǎng)心卡帕藻受到冰樣白化病暴發(fā)的危害而大規(guī)模死亡，養(yǎng)殖面積從上萬(wàn)畝銳減到幾十畝，給海藻養(yǎng)殖戶(hù)造成了嚴(yán)重?fù)p失[10]。

理論上，長(zhǎng)心卡帕藻存在無(wú)性繁殖和有性生殖方式，但該藻四分孢子嚴(yán)重退化，生殖細(xì)胞很難發(fā)現(xiàn)，因此到目前為止，有性生殖進(jìn)行該藻種苗培育和繁殖難以進(jìn)行。組織培養(yǎng)作為一種快速繁殖種苗技術(shù)已在優(yōu)良種苗的大量獲得和優(yōu)良種苗的種質(zhì)保存中顯示出越來(lái)越重要的作用[11]，目前關(guān)于海藻愈傷組織研究已有很多報(bào)道[12—14]，其中主要經(jīng)濟(jì)褐藻海帶、裙帶菜[15—16]以及紅藻中的江蘺[17—21]等都有較成熟的愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)。長(zhǎng)心卡帕藻的組織培養(yǎng)方面，雖然Dawes和Koch等[22]研究并證明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在該藻組織培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，但很遺憾未獲得愈傷組織。長(zhǎng)心卡帕藻屬低等大型海洋紅藻，在藻枝段上可直接長(zhǎng)出新芽，愈傷組織的產(chǎn)生則需要苛刻條件，并且獲得的愈傷組織形態(tài)也有所不同，例如Hayashi等[23]獲得了兩種愈傷組織，即似真菌絲狀愈傷組織和塊狀小細(xì)胞組成的致密愈傷組織，Hurtado和Biter[9]在組織培養(yǎng)再生新芽過(guò)程中，獲得了從枝段切面長(zhǎng)出的團(tuán)狀愈傷組織。但到目前為止，對(duì)于何種條件能誘導(dǎo)出何種形態(tài)的愈傷組織未有定論，對(duì)于愈傷組織的發(fā)生及來(lái)源過(guò)程也未見(jiàn)報(bào)道。

本文以PES液體與固體培養(yǎng)基(0.8%瓊脂)，采用正交設(shè)計(jì)，研究蔗糖、光照、植物生長(zhǎng)素(IAA和IBA)和細(xì)胞分裂素(6-BA)等對(duì)長(zhǎng)心卡帕藻枝段組織培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并檢測(cè)了長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的光合及呼吸速率等生理指標(biāo)的變化，為實(shí)現(xiàn)該藻愈傷組織誘導(dǎo)與分化提供基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料處理及消毒

棕色長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)取自海南省陵水黎族自治縣黎安鎮(zhèn)黎安灣，選取生長(zhǎng)良好枝段(直徑3～4 mm，長(zhǎng)度5～7 cm)，先去除藻體表面可見(jiàn)寄生或附生原生動(dòng)物及雜藻，然后用刷子在滅菌海水中反復(fù)清洗，期間在無(wú)菌淡水中仔細(xì)刷洗一次，再轉(zhuǎn)移到滅菌海水中刷洗，直至鏡檢無(wú)雜藻等污染物為止。在超凈工作臺(tái)中，按照無(wú)菌操作要求，先用0.7%的KI溶液(無(wú)菌海水配)浸泡消毒10 min，再用每毫升含1萬(wàn)單位青霉素、10 mg鏈霉素和250 μg兩性霉素B的無(wú)菌海水[23]浸泡12 h，之后用無(wú)菌海水沖洗至少3次，最后將藻段切成長(zhǎng)5～7 mm小段，備用。

2.2 培養(yǎng)基的配制

PES(Provasoli Enriched Seawater)液體培養(yǎng)基[24]：使用500 mL三角瓶，2 mL PES母液加入到100 mL海水中，再加入碳源——蔗糖，然后在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

PES固體培養(yǎng)基：PES液體培養(yǎng)基100 mL中加入0.8 g瓊脂(0.8%)，滅菌后，冷卻到40～50℃，在超凈工作臺(tái)中倒平板，每瓶倒3個(gè)平皿(每個(gè)約33 mL)，備用。

2.3 碳源(蔗糖)濃度實(shí)驗(yàn)

PES液體培養(yǎng)基添加蔗糖濃度梯度0、0.5、1.0、1.5 g/L，每個(gè)梯度選取20個(gè)長(zhǎng)心卡帕藻枝段(長(zhǎng)度5～7 mm)，3個(gè)平行，每周更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：光強(qiáng)(40±5) μmol/(m2·s)，光周期為14∶10(L∶D)，溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度75%。5周后統(tǒng)計(jì)枝段存活率、枝段發(fā)芽率。

(1)

(2)

2.4 枝段培養(yǎng)的正交實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)條件的篩選用正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)A(PES液體培養(yǎng)基、IAA、6-BA實(shí)驗(yàn))：用PES液體培養(yǎng)基，選取光照、植物生長(zhǎng)素IAA，細(xì)胞分裂素6-BA 3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，依據(jù)文獻(xiàn)[23，25]確定這3個(gè)水平大致范圍，選取光照強(qiáng)度23、41、54 μmol/(m2·s)，IAA濃度0、1、2 mg/L，6-BA濃度0、1、2 mg/L。采用正交表L9(34)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，如表1。

表1 長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織誘導(dǎo)的正交實(shí)驗(yàn)表

實(shí)驗(yàn)共9個(gè)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選用20個(gè)5～7 mm小枝段(9×20)，培養(yǎng)條件：溫度(26±1)℃，光周期14∶10(L∶D)，相對(duì)濕度75%，每周更換培養(yǎng)基，觀察枝段生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄枝段存活率和枝段發(fā)芽率，并觀察愈傷組織形成情況，如有愈傷組織產(chǎn)生，統(tǒng)計(jì)枝段愈傷組織發(fā)生率，

枝段愈傷組織發(fā)生率=

(有愈傷組織枝段數(shù)/存活枝段數(shù))×100%.

(3)

實(shí)驗(yàn)B(PES液體培養(yǎng)基、IBA、6-BA實(shí)驗(yàn))：更換植物生長(zhǎng)素，把IAA換成IBA，其他條件與實(shí)驗(yàn)A相同。

實(shí)驗(yàn)C(PES固體培養(yǎng)基、IBA、6-BA實(shí)驗(yàn))：植物生長(zhǎng)素是IBA，而液體培養(yǎng)基換成固體培養(yǎng)基，9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每實(shí)驗(yàn)組有3個(gè)平皿(3個(gè)平行)，每個(gè)平皿中培養(yǎng)7個(gè)小枝段(9×3×7)，培養(yǎng)基兩周更換一次，其他條件與實(shí)驗(yàn)A相同。

2.5 愈傷組織和枝段新芽形成過(guò)程的觀察及呼吸速率和光合速率的檢測(cè)

利用步驟2.4中PES固體培養(yǎng)基、IBA、6-BA組合獲得愈傷組織的最優(yōu)條件重新培養(yǎng)枝段，共選用18個(gè)平皿，每個(gè)平皿中10個(gè)小枝段，培養(yǎng)基兩周更換一次。愈傷和新芽出現(xiàn)后，分別選取大小盡量相同的愈傷枝段和發(fā)芽枝段(愈傷和發(fā)芽枝段各取5個(gè)，作為5個(gè)平行)，用Chlorolab-2氧電極(英國(guó)Hansatech公司)進(jìn)行耗/放氧速率檢測(cè)，然后計(jì)算出光合和呼吸速率；另外，在顯微鏡下觀察愈傷組織和新芽形成過(guò)程。

Chorolab-2氧電極的檢測(cè)方法[26—27]：取樣品枝段，在無(wú)菌海水中涮洗幾次，去除粘附的固體培養(yǎng)基，然后用滅菌濾紙吸除表面水分，稱(chēng)量后用無(wú)菌白色棉線(xiàn)細(xì)繩拴住，懸于反應(yīng)杯中，反應(yīng)介質(zhì)為含0.1 mol/L NaHCO3的滅菌海水，測(cè)光合時(shí)要打開(kāi)飽和光源，整個(gè)過(guò)程由軟件“Oxylab”程序控制，每次實(shí)驗(yàn)前都要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室溫度進(jìn)行校正，然后設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。

實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)采用t-test檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 蔗糖對(duì)長(zhǎng)心卡帕藻枝段存活率和發(fā)芽率的影響

培養(yǎng)2周，用肉眼可見(jiàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組都有枝段發(fā)芽，到5周時(shí)統(tǒng)計(jì)枝段存活數(shù)和發(fā)芽數(shù)，并計(jì)算出枝段存活率和枝段發(fā)芽率，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不加蔗糖，枝段存活率為(52.5±3.5)%，當(dāng)蔗糖濃度為0.5 g/L時(shí)，存活率相對(duì)較高，為(97.5±2.5)%，隨蔗糖濃度進(jìn)一步增加，存活率下降(見(jiàn)圖1a)；當(dāng)蔗糖濃度為0或0.5 g/L時(shí)，枝段發(fā)芽率較高(見(jiàn)圖1b)，分別為(71.8±11.6)%、(74.2±8.2)%，綜合考慮，選取蔗糖濃度0.5 g/L為后續(xù)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的最適碳源濃度。

3.2 枝段培養(yǎng)的正交實(shí)驗(yàn)

PES液體培養(yǎng)基、IAA、6-BA實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)A)：在實(shí)驗(yàn)A(表2)中，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的極差分析得出枝段存活最優(yōu)組合為：光強(qiáng)23 μmol/(m2·s)，IAA濃度1 mg/L，6-BA濃度0；枝段發(fā)芽最優(yōu)組合為：光強(qiáng)41 μmol/(m2·s)，IAA濃度2 mg/L，6-BA濃度0。但未形成愈傷組織。

表2 正交實(shí)驗(yàn)A(PES液體培養(yǎng)基、IAA、6-BA)和B(PES液體培養(yǎng)基、IBA、6-BA)的枝段培養(yǎng)情況

圖1 長(zhǎng)心卡帕藻枝段組織培養(yǎng)5周的枝段存活率(a)和枝段發(fā)芽率(b)Fig.1 Branch survival rate (a) and germination rate (b) of Kappaphycus alvarezii in 5 weeks

PES液體培養(yǎng)基、IBA、6-BA實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)B)：在實(shí)驗(yàn)B(見(jiàn)表2)中，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的極差法分析得出枝段發(fā)芽的最優(yōu)組合為：光強(qiáng)54 μmol/(m2·s)，IBA濃度1 mg/L，6-BA濃度0。但同樣未形成愈傷組織。

PES固體培養(yǎng)基、IBA、6-BA實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)C)：形成了愈傷組織(見(jiàn)圖2中黑色箭頭所示)，有的枝段一端發(fā)芽，另一端形成愈傷組織(見(jiàn)圖2a，2b)，有的枝段兩端產(chǎn)生愈傷組織(見(jiàn)圖2c)，但未觀察到兩端都發(fā)芽的枝段(實(shí)驗(yàn)A、B中也未觀察到)，而實(shí)驗(yàn)中愈傷組織可以?xún)啥硕籍a(chǎn)生，推測(cè)發(fā)芽可能有極性，而產(chǎn)生愈傷組織沒(méi)有極性；枝段培養(yǎng)情況統(tǒng)計(jì)如表3所示，實(shí)驗(yàn)組6有最高的枝段存活率，經(jīng)極差法分析，發(fā)芽率最優(yōu)組合為：光強(qiáng)54 μmol/(m2·s)，IBA濃度1 mg/L，6-BA濃度1 mg/L；愈傷組織產(chǎn)生率最佳組合為：光強(qiáng)54 μmol/(m2·s)，IBA濃度0，6-BA濃度2 mg/L。此結(jié)果表明：加6-BA同時(shí)不加IBA，有促進(jìn)愈傷組織產(chǎn)生的作用；另外，實(shí)驗(yàn)B中用的液體培養(yǎng)基，其余條件與實(shí)驗(yàn)C相同，但枝段沒(méi)有形成愈傷組織，說(shuō)明固體培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的形成起著關(guān)鍵作用。

表3 正交實(shí)驗(yàn)C(PES固體培養(yǎng)基、IBA、6-BA)的枝段培養(yǎng)情況

續(xù)表3

圖2 長(zhǎng)心卡帕藻枝段培養(yǎng)5周時(shí)產(chǎn)生的愈傷組織和新芽Fig.2 Callus formation and new buds germination in Kappaphycus alvarezii induced by PES solid medium with 0.8% agar after 5 weeks

圖3 長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織圖 Fig.3 Kappaphycus alvarezii callus by PES solid medium with 0.8% agar after 5 weeks

圖4 長(zhǎng)心卡帕藻枝段培養(yǎng)10天所形成的愈傷組織及長(zhǎng)出的新芽Fig.4 Callus formation and new bud germination in Kappaphycus alvarezii induced by PES solid culture medium with 0.8% agar after 10 days

3.3 長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織顯微觀察結(jié)果

長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織為堅(jiān)硬致密組織(圖2，圖3a)，對(duì)愈傷枝段進(jìn)行豎切并顯微觀察(見(jiàn)圖3a，3b)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞團(tuán)覆蓋于枝段橫切面，藻枝段皮層薄壁大細(xì)胞與絲狀愈傷組織細(xì)胞接觸部分的過(guò)渡細(xì)胞為直徑約10 μm，形態(tài)類(lèi)似成熟枝段的髓部小細(xì)胞，但愈傷組織具體是不是由髓部小細(xì)胞發(fā)育而來(lái)需要進(jìn)一步跟蹤觀察驗(yàn)證。顯微鏡下，愈傷細(xì)胞團(tuán)由細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞組成，細(xì)胞長(zhǎng)度從幾十微米到幾百微米不等，寬約10 μm；愈傷組織前端部分(見(jiàn)圖3c)，每個(gè)細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞前部連接有一圓形小細(xì)胞，推測(cè)細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞由圓形小細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育而來(lái)，進(jìn)一步對(duì)愈傷組織細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)有的長(zhǎng)細(xì)胞上有分支細(xì)胞，猶如樹(shù)枝主干分出來(lái)的支干(見(jiàn)圖3d)，分支細(xì)胞開(kāi)始為圓球形，后來(lái)逐漸也成為細(xì)長(zhǎng)狀。

對(duì)長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織形成過(guò)程跟蹤顯微觀察：在第7天時(shí)發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)新芽，第10天時(shí)觀察到肉眼可見(jiàn)愈傷；愈傷組織從枝段橫切面形成小凸起，呈透明狀(見(jiàn)圖4a)；通過(guò)跟蹤觀察愈傷組織的形成情況，發(fā)現(xiàn)愈傷細(xì)胞來(lái)源于藻枝段中心的髓部小細(xì)胞，在成熟長(zhǎng)心卡帕藻枝段中，髓部細(xì)胞較小，不同于皮層的薄壁大細(xì)胞，要形成愈傷組織時(shí)，髓部細(xì)胞拉長(zhǎng)，變成細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞，向外不斷增殖，呈發(fā)散狀向前生長(zhǎng)，最終形成愈傷組織(見(jiàn)圖4b)；而跟蹤觀察形成新芽的枝段(見(jiàn)圖4c)，新芽也是由髓部細(xì)胞形成，但僅是髓部細(xì)胞的增大、增殖過(guò)程，并未見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞，新芽細(xì)胞和原組織細(xì)胞形態(tài)一致，并且表面有含色素的表皮細(xì)胞層，使外觀來(lái)看新芽顏色較深，不同于愈傷組織的無(wú)色透明狀(見(jiàn)圖4d)。因此，推測(cè)髓部小細(xì)胞的形態(tài)變化(即是否進(jìn)行脫分化)決定著形成愈傷還是新芽。

3.4 長(zhǎng)心卡帕藻產(chǎn)生愈傷組織與萌發(fā)新芽?jī)蓚€(gè)不同過(guò)程及發(fā)生時(shí)的光合和呼吸速率變化

在對(duì)長(zhǎng)心卡帕藻的培養(yǎng)過(guò)程中，藻枝段形成的愈傷組織在第10天肉眼可見(jiàn)，在接下來(lái)培養(yǎng)的35天中，愈傷組織的生長(zhǎng)表現(xiàn)為致密細(xì)胞團(tuán)的增大，細(xì)胞團(tuán)顏色較淺，表層沒(méi)有帶色素的深色細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞仍為細(xì)長(zhǎng)狀；而發(fā)芽枝段的新芽生長(zhǎng)表現(xiàn)為變粗變長(zhǎng)，表面始終有深色表皮細(xì)胞覆蓋，未見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞。圖5為培養(yǎng)過(guò)程中15天、25天、35天時(shí)愈傷枝段和發(fā)芽枝段的形態(tài)。

通過(guò)測(cè)定愈傷枝段和發(fā)芽枝段過(guò)程中的光合及呼吸速率，發(fā)現(xiàn)愈傷枝段呼吸速率和光合速率都比發(fā)芽枝段的高(見(jiàn)圖6)，在第10天開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織時(shí)，愈傷枝段的光合速率為(111.7±38.2) nmol/(min·g)(以氧計(jì))，而發(fā)芽枝段的光合速率只有(59.0±13.2) nmol/(min·g)(以氧計(jì))；愈傷枝段的呼吸速率為(105.2±41.5)nmol/(min·g)(以氧計(jì))，也顯著高于發(fā)芽枝段的(57.6±26.2)nmol/(min·g)(以氧計(jì))，提示我們，藻枝段上愈傷組織的出現(xiàn)比新芽的出現(xiàn)都有著較高的細(xì)胞生理活性。但長(zhǎng)心卡帕藻是如何控制產(chǎn)生愈傷組織或新芽的機(jī)制還需深入研究。

圖5 長(zhǎng)心卡帕藻的愈傷枝段和新芽枝段在培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化Fig.5 The morphological changes of Kappaphycus alvarezii callus and new bud in culturing

圖6 培養(yǎng)10天時(shí)長(zhǎng)心卡帕藻愈傷枝段和新芽枝段光合速率與呼吸速率(不同小寫(xiě)字母代表顯著性差異，p<0.05)Fig.6 Photosynthetic rate and respiratory rate of 10 days cultured Kappaphycus alvarezii branch with callus and new bud，respectively(The different lowercase letters indicate significant differences among treatments，p<0.05)

4 討論

組織培養(yǎng)技術(shù)能夠快速繁殖稀有或較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，對(duì)于植物種質(zhì)資源的保存、挽救瀕臨滅絕植物都有重要作用。海洋藻類(lèi)方面，已經(jīng)報(bào)道超過(guò)85種海藻的組織培養(yǎng)研究，其不僅在海藻優(yōu)良種苗培育上有重要作用，而且也促進(jìn)了海藻醫(yī)藥保健品等高附加值產(chǎn)品的生物加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[28—29]。本研究中的長(zhǎng)心卡帕藻是一種生產(chǎn)卡拉膠的重要原材料，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其組織培養(yǎng)的研究對(duì)于其優(yōu)良種苗選育和種質(zhì)保存都有重要意義[30]。目前對(duì)于長(zhǎng)心卡帕藻的組織培養(yǎng)研究表明，能夠通過(guò)組培技術(shù)較易得到長(zhǎng)心卡帕藻新芽[22]，但得到愈傷組織往往需要苛刻條件。在紅藻的愈傷組織研究中，Gusev等[31]發(fā)現(xiàn)蔗糖和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)洋菜植物(Agarophytemarinealgae)愈傷組織的形成有著重要作用，Yokoya等[32—33]發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA對(duì)紅藻Chondracanthuschamissoi和紅藻Solieriafiliformis愈傷組織的產(chǎn)生有刺激作用，而Robledo和Garcia-Reina[34]又發(fā)現(xiàn)靜置的液體培養(yǎng)基不能使紅藻Solieriafiliformis產(chǎn)生愈傷組織，在本實(shí)驗(yàn)中，我們也印證了蔗糖、固體培養(yǎng)基、6-BA在紅藻——長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織產(chǎn)生中的重要作用，用0.5 g/L蔗糖、PES固體培養(yǎng)基、2 mg/L 6-BA、未加植物生長(zhǎng)素組合能高效誘導(dǎo)出愈傷組織。此外，在誘導(dǎo)得到的長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織的形態(tài)上，不同人的研究結(jié)果有所不同。Hayashi等和Zitta等[23，35]得到的為絲狀愈傷組織，形態(tài)上看類(lèi)似真菌菌絲，而本實(shí)驗(yàn)中得到的愈傷組織為如瘤狀的致密細(xì)胞團(tuán)，由不含色素的細(xì)長(zhǎng)狀細(xì)胞組成，這與Reddy等[36]得到的愈傷組織非常類(lèi)似，他們用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出了細(xì)絲狀愈傷(filamentous callus)，對(duì)比分析，我們推測(cè)當(dāng)培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基中，長(zhǎng)心卡帕藻橫切枝段的切面(即受傷面)接觸固體培養(yǎng)基的部分，均長(zhǎng)成瘤狀致密細(xì)胞團(tuán)的愈傷組織，而其未接觸固體培養(yǎng)基、暴露在空氣中部分可能會(huì)長(zhǎng)出絲狀愈傷組織，但本實(shí)驗(yàn)中枝段受傷面是貼于固體培養(yǎng)基中的，故此得到了致密愈傷。在本研究中，我們又對(duì)愈傷組織的形成過(guò)程進(jìn)行了跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)愈傷組織來(lái)源于髓部小細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中，形成愈傷組織的愈傷枝段與形成新芽的發(fā)芽枝段相比，前者的光合速率和呼吸速率都較高，提示我們，產(chǎn)生愈傷組織時(shí)枝段組織細(xì)胞會(huì)有較高的生理活性，但具體什么原因造成的這種現(xiàn)象，還有待進(jìn)一步的研究。

本研究采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)降低實(shí)驗(yàn)工作量，探索摸索出了一條新的獲得長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織的方法，并初步探討了愈傷組織發(fā)生來(lái)源及發(fā)生過(guò)程中的生理變化，對(duì)于長(zhǎng)心卡帕藻在培養(yǎng)過(guò)程中如何精密控制產(chǎn)生愈傷組織還是新芽、愈傷組織再分化等問(wèn)題，需進(jìn)一步的探索。

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Callus induction and morphogenesis of callus inKappaphycusalvarezii(Rhodophyta，Solieriaceae)

Li Hu1，2，Liu Jianguo1，Pang Tong1

(1.InstituteofOceanology，ChineseAcademyofSciences，Qingdao266071，China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China)

The brown morphotype of red seaweedKappaphycusalvareziicollected from Li’an Bay in Lingshui County，Hainan Province of China，was used as explants in order to generate new buds and induce callus. Effect of the PES (Provasoli enriched seawater) media (with or without gelling agent)，light intensity，and phytoregulators (Indole-3-acetic acid (IAA)，Indole-3-butyric acid (IBA)，6-benzylaminopurine (6-BA)) were tested on new bud generation and callus formation by orthogonality experiment. The callus forming was observed in microscope，and the changes of the respiration rate and photosynthesis rate in explants among callus forming were detected. The callus ofKappaphycusalvareziiwas achieved successfully by the combination of PES solid medium (0.8% ager)，IBA，6-BA，while callus was not observed in the combination of PES liqiud medium，IBA and 6-BA. That indicates the solid medium plays an important role in callus induction.Kappaphycusalvareziicallus which consists of compact filamentous cells was different from the loose callus of superior plants. And callus derived from the medullary cells. It was found that both photosynthetic rate and respiratory rate in the branch inducing callus were higher than ones of the branch germinating new bud by means of oxygen electrode．

Kappaphycusalvarezii; tissue culture; callus; oxygen electrode; photosynthesis and respiration

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.04.005

2014-05-21；

2014-12-18。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(41306154)；青島市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范成果轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目。

李虎(1988-)，男，河南省濮陽(yáng)市人，博士研究生，主要研究方向?yàn)樵孱?lèi)生理。E-mail: li_hu2007@163.com

*通信作者：劉建國(guó)，博士，研究員，主要研究方向?yàn)樵孱?lèi)和藻類(lèi)生物技術(shù)。E-mail:jgliu@qdio.ac.cn

Q945.52

A

0253-4193(2015)04-0052-10

李虎，劉建國(guó)，龐通. 長(zhǎng)心卡帕藻愈傷組織的誘導(dǎo)與其形態(tài)建成的初步研究[J].海洋學(xué)報(bào)，2015，37(4)：52—61，

Li Hu，Liu Jianguo，Pang Tong. Callus induction and morphogenesis of callus inKappaphycusalvarezii(Rhodophyta，Solieriaceae)[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(4)：52—61，doi: 10.3969/j.issn.0253-4193.2015.04.005