蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因組分析

劉志敏，劉文獻，賈喜濤，張正社，王彥榮

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因組分析

劉志敏，劉文獻，賈喜濤，張正社，王彥榮

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)是一類在種子胚胎發(fā)育后期特異表達并受發(fā)育階段及脫水信號調(diào)節(jié)的脫水保護蛋白，在響應(yīng)植物干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫中具有重要功能。本研究利用生物信息學(xué)手段，在全基因組水平對蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)LEA基因家族進行分析，并對其進化、基因結(jié)構(gòu)、進化壓力、染色體定位及基因表達模式進行了系統(tǒng)分析。本研究共篩選出23個蒺藜苜蓿LEA家族基因，可分為8個亞家族?；蚨ㄎ唤Y(jié)果表明，23個蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6號染色體外的其他7條染色體上，但分布不均勻；家族成員外顯子數(shù)目都不超過兩個，結(jié)構(gòu)簡單。不同組織表達譜分析結(jié)果顯示，LEA家族基因具有不同的組織表達模式，并受干旱逆境脅迫調(diào)控。本研究結(jié)果可為蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基礎(chǔ)。

蒺藜苜蓿；LEA基因家族；系統(tǒng)進化；表達分析

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Proteins，LEA)最早發(fā)現(xiàn)于棉花(Gossypiumhirsutum)子葉中，因其在植物胚胎發(fā)育后期大量表達而得名[1-2]。LEA基因家族分布廣泛，不僅存在于被子植物、裸子植物和藻類中[3-4]，在線蟲(Aphelenchusavenae)[5]、輪足蟲(Rotifer)[6]和藍細菌(Cyanobacteria)[7]中也普遍存在。根據(jù)蛋白質(zhì)序列同源性及其特殊的基元序列，可將LEA蛋白分為不同類群[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，不同LEA蛋白都具有高親水性和熱穩(wěn)定性，并富含甘氨酸或其他氨基酸類(如丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)[4]。LEA基因家族系統(tǒng)進化分析最先在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中被報道，其共有51個成員[12]，隨后在水稻(Oryzasativa)[13]、大豆(Glycinemax)[14]和楊樹(Populus)[15]中也發(fā)現(xiàn)分別含有34、35和40個LEA基因。

植物L(fēng)EA蛋白及其轉(zhuǎn)錄本累積水平主要在種子胚胎發(fā)育后期、種子脫水之前顯著提高；當植物處于滲透脅迫、脫水以及低溫脅迫條件下，該類蛋白也會在植物營養(yǎng)組織中高水平累積，與植物耐脫水性密切相關(guān)，具有保護植物組織免受水分脅迫傷害的功能[16-19]。前人研究結(jié)果顯示，LEA基因家族受多種逆境脅迫調(diào)控表達[20]。例如，在干旱和低溫脅迫條件下，青楊(P.cathayana)LEA2、LEA3基因在葉片中的表達量顯著提高[21]。在干旱條件下，擬南芥營養(yǎng)組織中LEA蛋白累積量升高[22]；當擬南芥AtLEA4基因在擬南芥中過表達后，其抗旱性相比野生型顯著提高，AtLEA4基因表達量降低則導(dǎo)致擬南芥對干旱脅迫更為敏感[23]。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)誘導(dǎo)擬南芥LEA14及其同源脫水蛋白(LEA34和LEA51)表達量降低后，種子貯存壽命顯著降低，說明LEA蛋白對種子貯存具有十分重要的作用[24]。小麥(Triticumaestivum)TaLEA2和TaLEA3分別在酵母細胞中過表達后，相比之對照，轉(zhuǎn)化酵母細胞的抗干旱和耐低溫脅迫能力都顯著增強[25]。在中華羊草(Leymuschinensis)中過表達TaLEA3后，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性顯著提高[26]。小麥的PMA1959(LEA1)和PMA80(LEA2)基因在水稻中過表達可明顯提高轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的葉綠素含量和根系的重量[27]。另外，在草莓(Fragaria)中過表達小麥LEA(WCOR410)基因后能顯著提高草莓葉片的抗寒性[28]，而將大麥(Hordeumvulgare)LEA(HVA1)分別在水稻和小麥中過表達后能同時提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性和耐鹽性[29-30]。

蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)是紫花苜蓿(M.sativa)的近緣種，具有生長周期短、自花授粉、基因組小且遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點，使其成為研究豆科，特別是苜蓿屬植物，基因組學(xué)和生物學(xué)的模式植物[31]。蒺藜苜蓿全基因組測序已經(jīng)完成，使得利用生物信息學(xué)手段研究該物種基因家族系統(tǒng)演化及其功能成為可能，同時借鑒蒺藜苜蓿研究及其基因資源對促進豆類作物遺傳研究具有重要意義[32]。截至目前，在全基因組水平對蒺藜苜蓿LEA基因家族的研究尚未見報道。本研究利用生物信息學(xué)手段，從全基因組水平對蒺藜苜蓿LEA基因家族的結(jié)構(gòu)特征、進化關(guān)系、染色體位置及表達模式進行系統(tǒng)分析，以期為進一步研究LEA蛋白家族功能和豆科牧草作物遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒺藜苜?；蚪M序列下載于JCVI數(shù)據(jù)庫(http://jcvi.org/medicago/index.php)，擬南芥LEA基因序列和蛋白質(zhì)序列下載于Phytozome數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)[33]。蒺藜苜蓿芯片探針數(shù)據(jù)來自Affymetrix公司(http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx)[34]，所得探針于諾貝爾基金會(Noble Foundation)數(shù)據(jù)庫(http://mtgea.noble.org/v3/)[35-36]搜索LEA基因在各器官中的表達量，進行基因表達分析。

1.2 蒺藜苜蓿LEA基因家族成員鑒定

以蒺藜苜蓿全基因組序列構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫，利用已鑒定出的51個擬南芥LEA基因家族成員執(zhí)行本地BLAST(P-value=le-003)搜索同源序列。利用Pfam數(shù)據(jù)庫[37]對獲得的蒺藜苜蓿同源LEA基因進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，篩選含有LEA典型結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。利用Expasy蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(http://web.expasy.org/protparam/)對蒺藜苜蓿LEA蛋白進行蛋白質(zhì)分子量、理論等電點和總平均親水性預(yù)測[38]。

1.3 蒺藜苜蓿LEA基因染色體定位

利用Phytozome植物全基因組數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)確定蒺藜苜蓿LEA基因染色體位置，利用Mapchart 2.2工具[39]進行染色體定位作圖。

1.4 蒺藜苜蓿LEA基因家族成員系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 6.0[40]對蒺藜苜蓿LEA蛋白進行多序列聯(lián)配比對分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化樹選用p-distance模型，校驗參數(shù)Bootstrap設(shè)為1 000次重復(fù)。利用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[41]分析LEA基因家族成員基因結(jié)構(gòu)。

1.5 蒺藜苜蓿LEA基因進化壓力分析

利用在線工具Clustal Omega[42]和PAL2NAL[43]計算核苷酸的同義替換率Ks(synonymous substitution rate or synonymous substitutions per synonymous site)、非同義替換率Ka(nonsynonymous substitution rate or nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site)及兩者比率Ka/Ks。

1.6 蒺藜苜蓿LEA基因表達分析

利用Affymetrix基因探針數(shù)據(jù)庫搜索蒺藜苜蓿LEA基因相匹配的探針，從蒺藜苜?；蛐酒脚_(http://mtgea.noble.org/v3/)獲得對應(yīng)探針表達量信息，并使用MeV4[44]軟件對蒺藜苜蓿LEA基因在不同組織、不同時期、不同處理的表達芯片數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)聚類分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿LEA基因家族的鑒定和分類

通過BLAST比對分析，本研究共初步篩選出32個候選蒺藜苜蓿LEA基因。將所得序列在Pfam網(wǎng)站進行基因結(jié)構(gòu)域分析并刪除不含LEA結(jié)構(gòu)域的基因，最終得到23個蒺藜苜蓿LEA基因。根據(jù)結(jié)構(gòu)域可將23個LEA基因分為8個亞家族(表1)，包括4個LEA1、2個LEA2、2個LEA3、5個LEA4、1個LEA5、2個LEA6、4個SMP和3個Dehydrin。利用在線工具ExPASy對蒺藜苜蓿LEA蛋白質(zhì)分子量、理論等電點系數(shù)和總平均親水性進行分析發(fā)現(xiàn)，23個LEA蛋白中分子量最大為55 384.9 D(LEA4-5)，最小為6 740.2 D(LEA4-4)；等電點的范圍從4.54(LEA7-4)到9.55(LEA1-4)不等；所有LEA蛋白除LEA2-2外均表現(xiàn)為親水性(表1)。

2.2 蒺藜苜蓿LEA基因家族染色體定位

蒺藜苜蓿LEA基因染色體定位結(jié)果顯示，23個基因分布于除第6條染色體以外的其他7條染色體上，但分布不均一(圖1)。其中，第2、4和7染色體上分布最多，各有5個LEA基因；其次為第1和第3染色體，各3個；第5和第8染色體上最少，各1個。LEA1-2/LEA1-3/LEA1-4、LEA4-2/LEA4-3、LEA7-2/LEA7-3及LEA8-1/LEA8-2在染色體上連鎖在一起，屬于旁系同源基因，其中LEA7-2/LEA7-3的步長值最高(100)。

2.3 蒺藜苜蓿LEA家族基因系統(tǒng)進化及其基因結(jié)構(gòu)分析

為研究蒺藜苜蓿LEA基因系統(tǒng)進化關(guān)系，對篩選出的蒺藜苜蓿LEA蛋白進行了系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(圖2)。分析結(jié)果顯示，23個蒺藜苜蓿LEA基因分布在6個無根系統(tǒng)進化樹，其中LEA1、LEA5和LEA8三個亞家族分布在同一分支上，并明顯地分為3個次亞家族；同時，其他5個亞家族也可明顯分為2個次亞家族且含有不同基因數(shù)。

利用GSDS在線工具對LEA基因結(jié)構(gòu)進行作圖分析。結(jié)果顯示，蒺藜苜蓿LEA基因結(jié)構(gòu)相對簡單，所含基因內(nèi)含子的數(shù)量均不多于兩個。其中LEA6-1、LEA6-2和LEA8-3不含有內(nèi)含子，LEA4-4、LEA7-1和LEA7-3均各含有兩個內(nèi)含子，剩余17個基因只含有1個內(nèi)含子(圖3)。

2.4 蒺藜苜蓿LEA基因進化選擇壓力分析

同義替換(Synonymous Substitution)和非同義替換(Nonsynonymous Substitution)是生物進化過程中核苷酸替換的兩種形式，Ka、Ks及Ka/Ks能反映出基因進化過程中受到的選擇壓力。對6對旁系同源基因的分析結(jié)果顯示(表2)，6對旁系同源基因Ka/Ks值在0.041 9到0.614 8之間，均小于1。其中，Ka/Ks最大值為LEA4-2和LEA4-3(0.614 8)；Ka/Ks最小值為LEA3-1和LEA3-2(0.041 9)，表明蒺藜苜蓿LEA基因進化時存在負向選擇作用[45]。

表1 蒺藜苜蓿LEA基因家族信息

2.5 蒺藜苜蓿LEA基因表達模式分析

利用MeV軟件對蒺藜苜蓿LEA家族基因表達模式進行分析，綠-黑-紅3個顏色表示基因的表達強度。綠色越強代表表達量越小，紅色越強代表表達量越大，黑色為中間值。本研究對蒺藜苜蓿LEA基因在不同組織(葉、葉柄、莖、花、果莢、種衣和根)、不同時期及不同水分脅迫處理的31個表達芯片數(shù)據(jù)進行了分析。

研究結(jié)果顯示，除LEA4-3僅在成熟種子中表達外，其他LEA基因在種子和種衣中都有較高的表達量，并具有隨著種子成熟度的增加表達量呈增高的趨勢(圖4)。其中，LEA1-2、LEA2-1、LEA2-2、LEA3-1、LEA4-4、LEA7-4、LEA8-2和LEA8-3在葉、葉柄、莖、花、果莢、種衣、根和種子中組成型表達，但LEA1-2在種衣和根,LEA3-1在果莢以及LEA7-4在根中表達量相對較低。而其他15個LEA基因僅在種衣和種子中特異表達。

圖1 蒺藜苜蓿LEA基因染色體定位Fig.1 The chromosome location of the LEA genes in Medicago truncatula

圖2 蒺藜苜蓿LEA基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 The unrooted dendrogram of all Medicago truncatula LEA genes

對水分脅迫處理的幼苗和根進行基因表達芯片數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，LEA5、LEA7-1、LEA7-2、LEA7-3、LEA1-1、LEA3-1、LEA2-1、LEA2-2、LEA8-2、LEA8-3、LEA4-3和LEA4-4表達量均無明顯變化，LEA4-2、LEA1-3、LEA4-5、LEA7-4和LEA8-1基因在幼苗和根中的表達量隨著干旱脅迫的加強表達量升高，恢復(fù)灌水后表達量急劇下降，LEA1-1、LEA1-4、LEA1-2、LEA4-1、LEA3-2、LEA6-1和LEA6-2僅在根中的表達受水分脅迫的調(diào)控，恢復(fù)灌水后呈明顯的下降趨勢；而LEA3-1在幼苗和根中隨著干旱脅迫處理和恢復(fù)灌水后，基因表達量表現(xiàn)為先下降后升高的趨勢。綜合分析蒺藜苜蓿LEA基因在不同組織和不同脅迫處理后的表達量表明，LEA5、LEA7-1、LEA7-2和LEA7-3在根和幼苗中表達量極低，卻不受干旱脅迫的調(diào)控，部分基因，如LEA2-1、LEA4-4、LEA2-2、LEA8-2和LEA8-3表達量無明顯變化；而部分基因表達量變化較大，例如在幼苗期干旱處理和根的形態(tài)建成過程中水分脅迫時，LEA3-2、LEA1-4、LEA6-1、LEA6-2、LEA4-2、LEA1-3、LEA4-5、LEA7-4和LEA8-1的表達量均增加，但LEA4-1和LEA1-1只在根形態(tài)建成過程中受水分脅迫時表達量增加而在幼苗期干旱處理中表達量減低；此外，LEA4-3在幼苗期干旱處理下特異表達，表明這些基因可能在植株幼苗期對干旱生境的抗逆響應(yīng)具有重要作用。

圖3 蒺藜苜蓿LEA家族基因結(jié)構(gòu)Fig.3 The gene structure of LEA gene family in Medicago truncatula

注：黃色框、黑色線條、藍色框分別表示外顯子、內(nèi)含子和非編碼區(qū)。

Note：The yellow boxes, black lines and blue boxes represent the exon, intron and untranslated region, respectively.

表2 蒺藜苜蓿LEA基因核苷酸替換率

3 討論與結(jié)論

隨著植物基因組研究的深入，利用比較基因組學(xué)方法分析和預(yù)測基因功能已成為目前植物基因功能研究的熱點之一。目前，在高等植物中已有的相關(guān)研究包括番茄(Lycopersiconesculentum)的LBD基因家族[46]、蒺藜苜蓿WRKY功能基因[47]以及大豆[14]、擬南芥[12]LEA蛋白家族分析等，對其種類、數(shù)目和進化特點的研究為各基因家族功能分析奠定了理論基礎(chǔ)。LEA蛋白是植物體內(nèi)廣泛存在的一系列蛋白質(zhì)，在植物抵御干旱、凍害等非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用，但蒺藜苜蓿LEA基因家族及其功能分析的研究尚未見報道。本研究通過生物信息學(xué)方法分析LEA家族基因，共鑒定出8個亞家族23個蒺藜苜蓿LEA蛋白家族基因。在擬南芥中，已鑒定出9個亞家族51個基因[12]，而水稻LEA蛋白家族基因則被分為7個亞家族34個基因[13]。在大豆中，已鑒定的LEA基因分為8個亞家族35個基因[14]，與蒺藜苜蓿中的基因分類數(shù)目一致。另外，LEA基因結(jié)構(gòu)分析表明，多數(shù)蒺藜苜蓿LEA基因只含有一個或不含有內(nèi)含子，只有3個LEA基因含兩個內(nèi)含子。大豆LEA基因中也只含有較少的內(nèi)含子，其中，只有兩個基因含有多個內(nèi)含子，其他都只含有一個或者無內(nèi)含子[14]，表明LEA基因家族的基因結(jié)構(gòu)相對較簡單。

圖4 蒺藜苜蓿LEA基因表達模式Fig.4 The expression profiles of Medicago truncatula LEA genes

注：圖中用綠-黑-紅三色代表基因表達水平。綠色越亮表達越弱，紅色越亮表達越強。

Note：The gene expression level is displayed with green-black-red scheme in the picture. The brighter the green, the weaker the expression; the brighter the red, the stronger the expression.

蒺藜苜蓿中LEA家族基因分布差異較大，其中LEA4基因數(shù)最多，含有5個；而LEA5基因數(shù)最少，僅有1個。基因定位數(shù)據(jù)顯示，第6條染色體上無LEA基因，最多的第2、4和7條染色體上各含有5個LEA基因。染色體定位和系統(tǒng)進化分析表明，有6對旁系同源基因于染色體上緊密連鎖在一起，可能是基因組串聯(lián)復(fù)制的結(jié)果[48]。另外，通過系統(tǒng)進化樹分析得出，LEA基因在進化上表現(xiàn)出差異性，暗示其基因功能的多樣性[49-50]。

根據(jù)蒺藜苜蓿LEA基因表達信息的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該LEA家族基因在組織表達上具有一定的特異性，且與耐旱性密切相關(guān)。15個LEA基因在種子發(fā)育時期特異表達，在種皮中也有大量表達，說明LEA基因家族對植物的種子發(fā)育具有較大影響；另外5個基因(LEA2-1、LEA2-2、LEA4-4、LEA8-2和LEA8-3)則在蒺藜苜蓿所有的組織中都表達，而LEA1-3和LEA1-4在葉和花中的表達量相較之其他非種子的表達量較高，從而使得該家族的基因功能表顯示出一定的多樣性和復(fù)雜性。有研究表明，LEA基因受干旱脅迫調(diào)控表達。例如，水稻OsLEA19a基因在幼苗中不表達，當受到干旱和高鹽處理后，其表達量快速增加，并在處理6 h后達到最高值[51]。與此對應(yīng)，在干旱脅迫下，13個基因(LEA1-2、LEA1-3、LEA1-4、LEA3-1、LEA3-2、LEA4-1、LEA4-2、LEA4-3、LEA4-5、LEA6-1、LEA6-2、LEA7-4和LEA8-1)有表達上調(diào)和下調(diào)的變化，說明其可能在植物響應(yīng)干旱脅迫中具有重要作用。

運用生物信息學(xué)手段，對蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因組進行分析，共鑒定出23個家族基因。23個家族基因可分為8個亞家族，并分布在除第6條染色體外的其他7條染色體上，且其基因中內(nèi)含子數(shù)目較少，結(jié)構(gòu)簡單?；蚪M織表達譜分析結(jié)果顯示，LEA家族基因組織表達模式差異較大，并受干旱逆境脅迫調(diào)控。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

Genome-wide analysis ofLEAgene family inMedicagotruncatula

LIU Zhi-min, LIU Wen-xian, JIA Xi-tao, ZHANG Zheng-she, WANG Yan-rong

(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Late embryogenesis abundant (LEA) family proteins are expressed abundantly at the late stage of embryonic development of plant seeds, and play important roles in responding to various environmental stress, such as drought, low temperature and high salinity. At present, the phylogenetic studies ofLEAgene family inMedicagotruncatulahave not been reported yet. In this study, with the application of bioinformatics methods, theLEAfamily genes ofM.truncatulawere identified through the whole genome, and the system evolution, gene structure, evolutionary pressure, chromosomal location and gene expression patterns were further analyzed. A total of 23LEAgenes were systematically identified fromM.truncatulaand classified into 8 subfamilies. Gene location results showed that these 23LEAgenes were distributed unevenly on 7 chromosomes; The exon numbers of all the genes were no more than two, indicating a simple gene structure of this gene family. The expression profiles ofM.truncatulaLEAgenes showed a characteristic of temporal and tissue specific, and regulated by drought stress. This study provides a theoretical foundation for verifying the function ofLEAgenes inM.truncatula.

Medicagotruncatula;LEAgene family; system evolution; expression analysis

LIU Wen-xian E-mail: liuwx@lzu.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0418

2014-09-16 接受日期：2014-12-11

國家草品種區(qū)域試驗項目——苜蓿品種“三性”測試(農(nóng)財發(fā)[2013]49號)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT13019)；蘭州大學(xué)中央高?；A(chǔ)研究基金項目(lzujbky-2013-82)

劉志敏(1990-)，男，江蘇贛榆人，在讀碩士生，主要從事草類種質(zhì)資源與育種研究。E-mail:liuzhm2013@lzu.edu.cn

劉文獻(1981-)，男，河南開封人，副教授，碩導(dǎo)，博士，主要從事草類種質(zhì)資源和分子生物學(xué)研究。E-mail:liuwx@lzu.edu.cn

S551+.703;Q943.2

A

1001-0629(2015)03-0382-10

劉志敏，劉文獻，賈喜濤，張正社，王彥榮.蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因組分析[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(3):382-391.

LIU Zhi-min,LIU Wen-xian,JIA Xi-tao,ZHANG Zheng-she,WANG Yan-rong.Genome-wide analysis ofLEAgene family inMedicagotruncatula[J].Pratacultural Science，2015,32(3)：382-391.