紫杉醇對大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖和膠原生成的影響

翟曉強(qiáng)，張 剛，付德來，李和程，李建平，種 鐵

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院泌尿外科，四川達(dá)州 635000)

·基礎(chǔ)研究·

紫杉醇對大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖和膠原生成的影響

翟曉強(qiáng)1，張 剛2，付德來1，李和程1，李建平1，種 鐵1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院泌尿外科，四川達(dá)州 635000)

目的 探討紫杉醇對大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖和膠原生成的影響。方法 組織塊接種法培養(yǎng)大鼠尿道成纖維細(xì)胞。以不同濃度紫杉醇(0、5、10、20、40、80 mg/L)處理尿道成纖維細(xì)胞，MTT法檢測成纖維細(xì)胞增殖能力，羥脯氨酸法檢測培養(yǎng)液中成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原生成，RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞中TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1等mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組不同濃度紫杉醇均對成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用。各組間細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。紫杉醇濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中膠原濃度、每十萬細(xì)胞膠原濃度比對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組尿道成纖維細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1的mRNA表達(dá)量均低于對照組 (P<0.05)。結(jié)論 紫杉醇可抑制大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖、膠原生成以及細(xì)胞中TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1的mRNA表達(dá)，紫杉醇在預(yù)防、治療尿道狹窄形成中的作用值得進(jìn)一步研究。

紫杉醇；尿道狹窄；成纖維細(xì)胞；瘢痕

尿道狹窄是泌尿外科的常見疾病，瘢痕狹窄是常見的并發(fā)癥，如何預(yù)防和處理是研究的熱點(diǎn)。尿道局部瘢痕的形成除了和術(shù)中瘢痕切除不徹底、尿道黏膜吻合不確切、術(shù)后局部感染等因素有關(guān)，同時(shí)也和損傷部位成纖維細(xì)胞的大量增殖、分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。紫杉醇是從紅豆杉中提取的一種抗腫瘤藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能抑制人皮膚瘢痕和血管外膜中成纖維細(xì)胞的增殖[1-2]。本課題研究紫杉醇對體外培養(yǎng)大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖及生物學(xué)功能的影響, 尋找預(yù)防和治療尿道狹窄的新方法。

1 材料與方法

1.1 大鼠尿道成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 取雄性大鼠尿道黏膜下組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(37℃、5%CO2、飽和濕度)，常規(guī)換液，傳代。波形蛋白單克隆抗體染色對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2 紫杉醇對成纖維細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×104/mL。設(shè)置不同濃度紫杉醇的給藥組(實(shí)驗(yàn)組)、對照組和空白組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組和對照組各加100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后棄原液，實(shí)驗(yàn)組加100 μL含不同濃度紫杉醇(5、10、20、40、80 mg/L)的培養(yǎng)液，對照組常規(guī)換液，空白組僅加100 μL的培養(yǎng)液。48 h后各孔加20 μL MTT溶液，孵育4 h后棄培養(yǎng)液，加150 μL二甲基亞砜，微孔振蕩器振蕩10 min。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測定A值(492 nm)，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率=(對照組A492nm-藥物組A492nm)/(對照組A492nm)×100%

1.3 紫杉醇對成纖維細(xì)胞膠原生成的影響 依照上述分組和培養(yǎng)方法，按羥脯氨酸測試盒說明書分別對實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中羥脯氨酸進(jìn)行測定。根據(jù)測得的吸光度和細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中膠原濃度和每十萬細(xì)胞膠原濃度。

羥脯氨酸含量(μg/mL)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(5 μg/mL)

膠原濃度(μg/mL)=羥脯氨酸含量(μg/mL)×7.46

每十萬細(xì)胞膠原濃度(μg/ mL)=105×膠原濃度(μg/mL)/每孔細(xì)胞數(shù)

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測紫杉醇對尿道成纖維細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 取對照組和實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描和定量分析，記錄各電泳條帶的積分吸光度。以TGF-β1、Ⅰ型膠原(Col1)、Ⅲ型膠原(Col3)及TIMP-1擴(kuò)增帶灰度與內(nèi)參照物β-actin灰度之比表示相應(yīng)mRNA 表達(dá)水平。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠尿道成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 大鼠尿道組織塊接種3 d后可見散在細(xì)胞生長出來，第4天細(xì)胞呈放射狀分布，第7天細(xì)胞相互融合成片，排列規(guī)律呈旋渦狀。經(jīng)波形蛋白單克隆抗體染色，培養(yǎng)的細(xì)胞胞質(zhì)被染成黃褐色，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞(圖1)。

圖1 組織塊接種法培養(yǎng)的大鼠尿道成纖維細(xì)胞(×400)

2.2 紫杉醇對成纖維細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組不同濃度紫杉醇對大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖均具有抑制作用(P<0.05)。紫杉醇濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。不同實(shí)驗(yàn)組間比較，各組間細(xì)胞抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度紫杉醇對成纖維細(xì)胞增殖的抑制率見圖2。

圖2 紫杉醇干預(yù)后各組成纖維細(xì)胞的細(xì)胞抑制率

2.3 紫杉醇對成纖維細(xì)胞膠原生成的影響 與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中膠原濃度均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中的紫杉醇濃度越高，培養(yǎng)液中膠原濃度越低(圖3A)。與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中每十萬細(xì)胞膠原濃度也低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中的紫杉醇濃度越高，培養(yǎng)液中每十萬細(xì)胞的膠原濃度越低(圖3B)。

圖3 紫杉醇干預(yù)后各組培養(yǎng)液中膠原濃度

A:膠原濃度; B:每十萬細(xì)胞膠原濃度。與對照組比較，*P<0.05。

2.4 紫杉醇對成纖維細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 TGF-β1、Col1、Col3、TIMP-1和β-actin的PCR電泳條帶如圖4所示。凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行吸光度分析(表1)。與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、Col1、Col3和TIMP-1的相對積分吸光度明顯降低(P<0.05)。紫杉醇濃度越高，相對蛋白或多肽鏈的相對積分吸光度越低。

表1 紫杉醇干預(yù)后成纖維細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)情況

與對照組比較，*P<0.05。

圖4 紫杉醇干預(yù)后成纖維細(xì)胞相關(guān)mRNA電泳條帶

圖中0、5、10、20、40、80分別代表紫杉醇濃度(mg/L)。

3 討 論

尿道狹窄治療的難點(diǎn)在于預(yù)防復(fù)發(fā)。除了手術(shù)技術(shù)改良外，其他輔助治療(包括藥物治療)是預(yù)防尿道狹窄復(fù)發(fā)的新思路。近年來發(fā)現(xiàn)多烯紫杉醇、雷帕霉素等藥物能顯著抑制兔尿道瘢痕的生成[3-4]。

成纖維細(xì)胞是人體結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，主要通過快速增殖、分泌大量膠原和細(xì)胞外基質(zhì)等參與機(jī)體創(chuàng)傷的修復(fù)，是尿道損傷后修復(fù)，特別是瘢痕生成過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞[5]。紫杉醇作為經(jīng)典抗腫瘤藥物在臨床上已廣泛應(yīng)用，近年來文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)它具有抗瘢痕作用[6]，理論上存在預(yù)防和治療尿道狹窄的可行性。我們實(shí)驗(yàn)中紫杉醇濃度的選擇主要參考了國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果[2,7]，將實(shí)驗(yàn)組中紫杉醇濃度分為：5、10、20、40、80 mg/L。

通過MTT法檢測細(xì)胞抑制率，我們發(fā)現(xiàn)紫杉醇對成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。紫杉醇濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。機(jī)制可能是紫杉醇通過調(diào)節(jié)細(xì)胞微管穩(wěn)定性，干擾靶細(xì)胞有絲分裂[8]。紫杉醇可以通過抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少成纖維細(xì)胞數(shù)量，減少膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，這在后續(xù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原濃度的實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的膠原濃度均顯著低于對照組。而且在各實(shí)驗(yàn)組中，紫杉醇濃度越高，培養(yǎng)液中的膠原濃度越低。通過調(diào)整培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，排除細(xì)胞數(shù)量對膠原生成的影響后，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中每十萬細(xì)胞的膠原濃度也顯著低于對照組。而且隨著實(shí)驗(yàn)組中紫杉醇濃度的增加，每十萬細(xì)胞的膠原濃度越低。這說明除了抑制成纖維細(xì)胞增殖外，紫杉醇還存在其他影響膠原生成的因素，需要我們后續(xù)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

TGF-β1是瘢痕形成過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，能通過自分泌或旁分泌形式作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分泌膠原和細(xì)胞外基質(zhì)[9]。我們通過RT-PCR法檢測成纖維細(xì)胞內(nèi)TGF-β1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紫杉醇能顯著抑制成纖維細(xì)胞自身表達(dá)TGF-β1，且抑制作用有濃度依賴性，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。所以，紫杉醇還可抑制成纖維細(xì)胞自身分泌TGF-β1，減輕對自身細(xì)胞增殖的刺激作用。

另外，細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積也參與組織的修復(fù)和瘢痕生成。細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積一方面與膠原合成、分泌增加有關(guān)，另一方面與膠原的降解減少有關(guān)[10]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是膠原降解的關(guān)鍵酶，它的活性受金屬蛋白酶組織抑制因子(metallopeptidase inhibitors，TIMPS)的調(diào)節(jié)。TIMP-1是TIMPS中最主要的一種，能與MMP-1按1∶1形成復(fù)合物，抑制其活性，達(dá)到抑制膠原降解的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能抑制大鼠尿道成纖維細(xì)胞中TIMP-1的表達(dá)，減輕對膠原酶的抑制作用，有利于細(xì)胞外基質(zhì)的降解，避免膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)紫杉醇在體外既能抑制大鼠尿道成纖維細(xì)胞增殖，又能抑制成纖維細(xì)胞的相關(guān)功能，包括膠原的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA的表達(dá)。展望未來紫杉醇可能在抑制尿道瘢痕生成、治療尿道狹窄方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)尿道外傷或尿道狹窄術(shù)后，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上局部使用一定濃度的紫杉醇，抑制局部瘢痕生成，預(yù)防尿道狹窄的發(fā)生。

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(編輯 何宏靈)

Effects of paclitaxel on the proliferation and collagen production of urethral fibroblasts in male rats

ZHAI Xiao-Qiang1, ZHANG Gang2, FU De-Lai1, LI He-Cheng1, LI Jian-Ping1, CHONG Tie1

(1. Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004;

2. Department of Urology, Dazhou Central Hospital, Dazhou 635000, China)

Objective To investigate the effects of paclitaxel on the proliferation and collagen production of urethral fibroblasts in male rats. Methods Urethral fibroblasts were cultivated with tissue inoculation, which were then treated with different concentrations of paclitaxel (0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L, 40 mg/L, 80 mg/L). Cell proliferation was evaluated with MTT assay. The production of collagen I and III were assessed with hydroxyproline assay. The mRNA expressions of TGF- β1, collagen Ⅰ,Ⅲ, and TIMP-1 in the fibroblasts were evaluated with RT-PCR. Results Compared with control group, cell proliferation was significantly inhibited by paclitaxel in the treatment groups. The inhibition rate was dose-dependently different between each group (P<0.05). In the treatment groups, collagen concentration and collagen expression per 105cells were lower than that in control, and the difference was statistically significant (P<0.05). Meanwhile, the mRNA expressions of TGF-β1, collagen I, collagen III and TIMP-1 were significantly lower compared with control (P<0.05). Conclusions Paclitaxel could significantly inhibit the proliferation and collagen production of rat urethra fibroblasts in vitro. Moreover, paclitaxel could reduce mRNA expressions of TGF-β1, collagen I, collagen III and TIMP-1. Further studies are deserved to investigate the effect of paclitaxel on the prevention and treatment of urethral stricture.

paclitaxel; urethral stricture; fibroblasts; scar

2015-03-25

2015-04-08

種鐵，教授.E-mail: chongtie@126.com

翟曉強(qiáng)(1982-)，男(漢族)，碩士，住院醫(yī)師.研究方向：男科疾病、泌尿系腫瘤.E-mail: zxq-200169@163.com

R34

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.016