毛果算盤(pán)子提取工藝及沒(méi)食子酸含量測(cè)定*

黃紅泓，甄漢深，柳賢福

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，南寧 530222；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

毛果算盤(pán)子提取工藝及沒(méi)食子酸含量測(cè)定*

黃紅泓1，甄漢深2，柳賢福1

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，南寧 530222；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

目的 建立測(cè)定廣西不同產(chǎn)地毛果算盤(pán)子中沒(méi)食子酸含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化毛果算盤(pán)子的提取工藝，用HPLC法測(cè)定毛果算盤(pán)子中沒(méi)食子酸的含量。色譜柱為Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。結(jié)果 沒(méi)食子酸在0.031～0.186 μg呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.999 9)，平均加樣回收率為102.81%，RSD為2.05%(n=9)。結(jié)論 所建立的方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于毛果算盤(pán)子藥材的質(zhì)量控制。

毛果算盤(pán)子；沒(méi)食子酸；提取工藝；含量測(cè)定；色譜法，高效液相

毛果算盤(pán)子為大戟科植物毛果算盤(pán)子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分，別名毛七公、漆大伯、兩面毛、漆大姑。味苦、澀，性平，全年可采收。具有驅(qū)風(fēng)利濕、散瘀、止血、消腫的功效，用于急性胃腸炎、痢疾、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、創(chuàng)傷出血、濕疹、漆瘡、皮炎等的治療[1]。其含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)[1-3]和三萜類(lèi)化合物，以及微量元素。韋松基等[4]對(duì)毛果算盤(pán)子和算盤(pán)子的顯微特征進(jìn)行了比較研究。劉布鳴等[5-6]采用薄層色譜研究表明，漆大姑藥材與沒(méi)食子酸對(duì)照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，并從漆大姑中分離出沒(méi)食子酸類(lèi)化合物。

已有文獻(xiàn)證實(shí)沒(méi)食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學(xué)活性[7]，對(duì)血管亦有收縮作用[8]。沒(méi)食子酸為毛果算盤(pán)子主要成分之一，其生物學(xué)活性與文獻(xiàn)記載的毛果算盤(pán)子功效相似，故選擇沒(méi)食子酸成分為含量測(cè)定指標(biāo)。目前文獻(xiàn)報(bào)道只有用薄層掃描法測(cè)定漆大姑中沒(méi)食子酸的含量，筆者尚未見(jiàn)高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定的報(bào)道。因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)中建立毛果算盤(pán)子中沒(méi)食子酸的HPLC測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫Agilent1200高效液相色譜儀，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(G-1313A)。LG16-W高速微量離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，SB3200T超聲波清洗儀(上海能信超聲有限公司)，Millipore Simplicity-185超純水儀(美國(guó)密里博公司)，BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯，精度：0.01 mg)。

1.2 試藥 沒(méi)食子酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-200803，供含量測(cè)定)。甲醇(美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司，批號(hào)：A372-4)、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司，批號(hào)：A943-4)，其余試劑為分析純(北京化工廠)。毛果算盤(pán)子藥材于2012年4月采自廣西10個(gè)地區(qū)，分別經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室寧小清副教授及廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室苑敏副教授鑒定，均為大戟科植物毛果算盤(pán)子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分(表1)。標(biāo)本存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院標(biāo)本室。

表1 毛果算盤(pán)子藥材編號(hào)與產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速為1.0 mL·min-1。柱溫20 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液的制備 取105 ℃干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品1.55 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶，加甲醇適量使溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.062 mg·mL-1沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。取毛果算盤(pán)子藥材粉末約1 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇40 mL，稱(chēng)重，靜置12 h，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液于離心管，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，即得。

2.3 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取上述沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和毛果算盤(pán)子供試品溶液各5 μL進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。沒(méi)食子酸的保留時(shí)間為6.0 min，與各自相鄰峰的分離度>1.5。

1.沒(méi)食子酸

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)照品(A)和毛果算盤(pán)子樣品(B)HPLC色譜圖

2.4 供試品處理的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)沒(méi)食子酸的性質(zhì)及初步預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)L9(34)進(jìn)行毛果算盤(pán)子的甲醇超聲提取工藝研究，以沒(méi)食子酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)表及分析結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 正交設(shè)計(jì)因素水平表

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時(shí)間

因素極差R越大，說(shuō)明因素的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析及方差分析可知，影響沒(méi)食子酸提取效果的因素大小順序?yàn)锳>B>C，即甲醇濃度>甲醇用量>提取時(shí)間，其中甲醇濃度和甲醇用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取方法為A3B3C2，即用100%甲醇40 mL超聲處理40 min。

表3 沒(méi)食子酸L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表與結(jié)果

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時(shí)間

為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，取3份S1號(hào)樣品粉末，按上述最優(yōu)工藝條件A3B3C2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按“1.2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸含量為0.93，0.91，0.89 mg·g-1。平均含量0.91 mg·g-1，RSD=1.98%。與正交實(shí)驗(yàn)方案中的最高值相同，說(shuō)明優(yōu)化成功。

表4 沒(méi)食子酸方差分析表

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時(shí)間

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，分別取上述6個(gè)不同濃度的對(duì)照溶液5 μL注入高效液相色譜儀，按“2.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，其色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，得出沒(méi)食子酸回歸方程為Y=3 090.8X+1.0，r=0.999 9；結(jié)果表明沒(méi)食子酸在進(jìn)樣量為0.031～0.186 μg之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取S1供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中沒(méi)食子酸的峰面積。結(jié)果測(cè)得樣品中沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.09%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1毛果算盤(pán)子藥材粉末1 g，精密稱(chēng)定，共取6份，按“2.2”項(xiàng)供試品制備方法制備， 精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算沒(méi)食子酸含量，RSD為2.02%。結(jié)果表明，用上述方法測(cè)定沒(méi)食子酸的含量，重復(fù)性好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1毛果算盤(pán)子藥材粗粉約1 g，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)供試品制備方法制備，室溫下保存，分別在0，2，6，10，16，24 h精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，考察穩(wěn)定性。結(jié)果測(cè)得樣品中沒(méi)食子酸峰面積RSD值為1.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量S1號(hào)樣品粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇40 mL，精密加入沒(méi)食子酸0.37，0.45，0.56 mg(加入量為樣品含量的80%，100%和120%)。按“2.2”項(xiàng)供試品制備方法制備，各平行制備3份，分別測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率(毛果算盤(pán)子藥材沒(méi)食子酸含量以0.91 mg·g-1計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，沒(méi)食子酸的平均加樣回收率為102.81%，RSD=2.05%。

表5 毛果算盤(pán)子加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果n=9

2.10 樣品測(cè)定 分別取廣西不同產(chǎn)地(2012年4月份采收)毛果算盤(pán)子藥材粉末(每個(gè)產(chǎn)地各3份)約1 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇40 mL，稱(chēng)質(zhì)量，靜置12 h，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液于離心管，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，即得。用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同產(chǎn)地毛果算盤(pán)子藥材含量測(cè)定結(jié)果n=3

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用HPLC法測(cè)定毛果算盤(pán)子中沒(méi)食子酸的含量，該方法簡(jiǎn)單，質(zhì)量控制方法切實(shí)可行，可在一定程度上反映毛果算盤(pán)子藥材的質(zhì)量。

不同產(chǎn)地的毛果算盤(pán)子中的沒(méi)食子酸含量差異較大。從不同產(chǎn)地毛果算盤(pán)子藥材含量測(cè)定結(jié)果可以看出，1，7號(hào)產(chǎn)地的毛果算盤(pán)子中沒(méi)食子酸的含量較高。

本文在前期單因素考察實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲醇的濃度越高提取效果越好，在50%甲醇提取條件下，提取效果并不佳。而在甲醇達(dá)到80%才能達(dá)到一定的提取效果，且每上一個(gè)10%濃度梯度，提取的效果存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了甲醇80%，90%，100%3個(gè)濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示100%甲醇提取效果最佳，且甲醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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[2] 廣州市藥品檢驗(yàn)所.農(nóng)村中草藥制劑技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1971：233.

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.029

2014-01-21

2014-02-15

*廣西高校科學(xué)資助項(xiàng)目(LX2014668)

黃紅泓(1977-)，女，廣西梧州人，講師，碩士，從事藥學(xué)和中藥學(xué)教學(xué)和科研工作。電話(huà)：0771-4736399，E-mail：929762704@qq.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0392-03