烏桕葉片中抑螺提取物的主要化學(xué)成分分析

楊永峰, 孫啟祥

(1. 國(guó)家林業(yè)局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院, 北京 100714; 2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所, 北京 100091)

烏桕葉片中抑螺提取物的主要化學(xué)成分分析

楊永峰1, 孫啟祥2

(1. 國(guó)家林業(yè)局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院, 北京 100714; 2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所, 北京 100091)

烏桕; 釘螺; 抑螺成分; GC-MS

血吸蟲病是嚴(yán)重危害人類生命健康的寄生蟲病，中國(guó)是血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一[1-2],雖然近期得到了有效控制，但局部地區(qū)并不樂(lè)觀[3]。主要原因之一是無(wú)法有效控制血吸蟲病中間宿主釘螺的傳播。濕熱適宜地區(qū)釘螺生命力異?；钴S，很難徹底清除，致使部分區(qū)域血吸蟲病依然蔓延，因此，抑制釘螺即可有效控制血吸蟲病[4]。生物法是費(fèi)效比最低、對(duì)環(huán)境污染最小的抑螺方法[5]。

烏桕〔Sapiumsebiferum(Linn.) Roxb.〕是重要的經(jīng)濟(jì)植物之一，在濕熱地區(qū)栽培甚廣[6]，也是一種很好的抑螺植物[4]。以烏桕林為主形成的微環(huán)境及產(chǎn)生的化感物質(zhì)能顯著降低灘地釘螺密度與陽(yáng)性感染螺密度[7]；烏桕葉片石油醚提取物具有很強(qiáng)的抑螺效果[8]。在前期工作的基礎(chǔ)上，作者結(jié)合抑螺實(shí)驗(yàn)采用柱分離技術(shù)和GC-MS法，分離和鑒定抑螺提取物的主要成分，以期為血吸蟲病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

烏桕新鮮葉片于2013年5月采自湖北省林業(yè)科學(xué)研究院九峰林業(yè)基地。葉片用蒸餾水洗凈后，在60 ℃烘箱里烘干，粉碎后過(guò)30目篩，密封、備用。釘螺采自湖北省荊州市沙市區(qū)，在去氯水中飼養(yǎng)2 d(25 ℃)；挑選個(gè)體一致、活力較強(qiáng)的成螺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7-8]。

正己烷、三氯甲烷和二氯甲烷均為分析純，重蒸后使用；甲醇為色譜純。薄層層析硅膠板GF254購(gòu)自安徽良臣硅源材料有限公司；柱層析硅膠(0.075～0.150 mm，購(gòu)自青島海洋化工廠。

1.2 方法

1.2.1 柱分離實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 抑螺活性成分的粗分離 采用濕法將弗羅里硅土裝到填充柱中，用500 mL正己烷沖洗填充柱；裝入葉片粉末100 g并依次用正己烷、正己烷-二氯甲烷混合溶液(體積比1∶1)、二氯甲烷、甲醇洗脫，每種洗脫液1 L，以1 min 10滴左右的速度洗脫，收集洗脫液。以三氯甲烷-甲醇-蒸餾水混合溶液(體積比12∶7∶1)作為展開(kāi)劑，用薄層硅膠板鑒別各洗脫液，經(jīng)熒光照射檢驗(yàn)后合并洗脫成分相同的洗脫液，減壓濃縮、真空干燥。參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行抑螺實(shí)驗(yàn)，確定抑螺效果顯著的提取物。

1.2.1.2 抑螺活性成分的細(xì)分離 采用濕法將200～300目硅膠裝入細(xì)分離層析柱中，先用300 mL甲醇沖洗凈化柱材料，再裝入抑螺效果顯著的提取物2 g，使用甲醇進(jìn)行洗脫，并蒸餾水混合溶液(體積比12∶7∶1)作為展開(kāi)劑，用薄層硅膠板鑒別各洗脫液，經(jīng)熒光照射檢驗(yàn)后合并洗脫成分相同的洗脫液，減壓濃縮至干。參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行抑螺實(shí)驗(yàn)，確定抑螺活性最強(qiáng)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組提取物。每組分別取約2 mg提取物，溶解于1 mL正己烷中，用無(wú)水硫酸鈉脫水12 h以上，然后吸取2 μL進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及條件 采用QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件為：DB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃。毛細(xì)管柱程序升溫條件為：初始溫度50 ℃，保 持2 min； 以1 ℃·min-1速率升溫至60 ℃， 保 持2 min； 以 3 ℃·min-1速率升溫至150 ℃，保持2 min；最后以10 ℃·min-1速率升溫至230 ℃，保持6 min。載氣為氦氣，恒壓模式分離。離子源溫度200 ℃；EI離子源，電離電壓70 eV；質(zhì)量掃描范圍40～600 amu；傳輸線溫度250 ℃。

采用NIST 107及Wiley 6.0質(zhì)譜圖庫(kù)，根據(jù)相似度初步確定各成分[9-10]。

2 結(jié)果和分析

烏桕葉片中抑螺提取物(Ⅰ～Ⅳ組)的抑螺活性成分的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1-A可見(jiàn)，Ⅰ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有7個(gè)較大的色譜峰，初步確定化合物1為3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol(3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇)，相似度91%；化合物2為6-chloro-N-ethyl-1，3，5-triazine-2，4-diamine(6-氯-N-乙基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)，相似度85%；化合物3為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度91%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇,相似度93%；化合物5為hexadecanoic acid(棕櫚酸)，相似度96%；化合物6為9，12，15-octadecatrienoic acid-2，3-dihydroxypropyl ester(9，12，15-三烯-十八酸-2，3-二丙二醇酯)，相似度86%；化合物7為octadecanoic acid(十八酸)，相似度87%。

由于化合物1、化合物3和化合物4的質(zhì)譜圖極為相似，但保留時(shí)間不同，推測(cè)它們互為異構(gòu)體，且3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇和棕櫚酸的峰面積較大，即二者相對(duì)含量較高，推測(cè)其是抑螺活性成分的幾率較高。

A. Ⅰ組抑螺提取物 Group Ⅰ of oncomelania-inhibited extract: 1,3,4: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 2: 6-chloro-N-ethyl-1，3，5-triazine-2，4-diamine; 5: hexadecanoic acid; 6: 9，12，15-octadecatrienoic acid-2，3-dihydroxypropyl ester; 7: octadecanoic acid. B. Ⅱ組抑螺提取物 Group Ⅱ of oncomelania-inhibited extract: 1: hexadecanoic acid methyl ester; 2: 9，12-octadecadienoic acid methyl ester; 3: 9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester; 4: octadecanoic acid methyl ester; 5: 1，2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl) ester. C. Ⅲ組抑螺提取物 Group Ⅲ of oncomelania-inhibited extract: 1: tetradecanoic acid; 2,4,5: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 3: 3，7，11-trimethyl-1-dodecanol; 6: 2，6，10-trimethyl-tetradecane; 7: hexadecanoic acid; 8: octadecanoic acid; 9: 1，2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl) ester. D. Ⅳ組抑螺提取物 Group Ⅳ of oncomelania-inhibited extract: 1,2,3,4: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 5: hexadecanoic acid; 6: 8，11，14-eicosatrienoic acid; 7: 9-octadecenoic acid; 8: 9-octadecenamide; 9: [(2-fluorophenyl)methyl]-1H-purin-6-amine.

圖1 烏桕葉片抑螺提取物(Ⅰ～Ⅳ組)的總離子流色譜圖

Fig. 1 Total ion chromatogram of oncomelania-inhibited extracts (groupⅠ-Ⅳ) from leaf ofSapiumsebiferum(Linn.) Roxb.

由圖1-B可見(jiàn)，Ⅱ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有5個(gè)較大的色譜峰，初步確定化合物1為hexadecanoic acid methyl ester(十六酸甲酯)，相似度97%；化合物2為9，12-octadecadienoic acid methyl ester(9，12-十八烯酸甲酯)，相似度97%；化合物3為9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester(9，12，15-十八烯酸甲酯)，相似度93%；化合物4為octadecanoic acid methyl ester(十八酸甲酯)，相似度97%；化合物5為1，2-benzenedicarboxylic acid bis (2-ethylhexyl) ester〔1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)〕，相似度97%。

由圖1-C可見(jiàn)，Ⅲ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有9個(gè)較大的色譜峰，初步確定化合物1為tetradecanoic acid(十四酸)，相似度95%；化合物2為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物3為3，7，11-trimethyl-1-dodecanol(3，7，11-三甲基-1-二十醇)，相似度86%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物5為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度95%；化合物6為2，6，10-trimethyl-tetradecane(2，6，10-三甲基-二十四烷)，相似度84%；化合物7為棕櫚酸，相似度93%；化合物8為octadecanoic acid(二十酸)，相似度94%；化合物9為1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)，相似度89%。

由圖1-D可見(jiàn)，Ⅳ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有9個(gè)較大的色譜峰，初步確定化合物1為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物2為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物3為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度93%；化合物5為棕櫚酸，相似度95%；化合物6為8，11，14-eicosatrienoic acid(8，11，14-烯-二十酸)，相似度89%；化合物7為9-octadecenoic acid(9-烯-十八酸)，相似度89%；化合物8為9-octadecenamide(9-烯-十八胺)，相似度98%；化合物9為[(2-fluorophenyl)methyl]-1H-purin-6-amine〔[(2-氟苯基)甲基]-1-H-吡啶-6-胺〕，相似度81%。

上述研究結(jié)果顯示：3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇、棕櫚酸、9，12，15-十八烯酸甲酯、1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)和8，11，14-烯-二十酸的相對(duì)峰面積較大。這些成分分別屬于烯醇、有機(jī)酸及酯類大分子化合物，沸點(diǎn)低于250 ℃、穩(wěn)定性好且較容易氣化，適合用氣相色譜測(cè)定。樣品中極性較大、沸點(diǎn)高、難以氣化的成分需進(jìn)行HPLC-MS分析。

3 結(jié) 論

從烏桕葉片抑螺提取物中分離得到的3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇、棕櫚酸、9，12，15-十八烯酸甲酯、1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)和8，11，14-烯-二十酸等成分的相對(duì)峰面積較大。由于棕櫚酸具有抑制胰島GLUT2、INS、PDX-1 mRNA表達(dá)[11]，導(dǎo)致肌細(xì)胞斷裂、凋亡[12]以及抗蟲[13]等的作用，因此，推測(cè)棕櫚酸是烏桕抑螺的活性物質(zhì)之一。

相對(duì)于傳統(tǒng)的物理與化學(xué)藥物，植物抑螺具有經(jīng)濟(jì)高效、生態(tài)環(huán)保和效用持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，利用植物抑螺技術(shù)防治血吸蟲病有著極其廣闊的應(yīng)用前景。研究烏桕葉片抑螺提取物的主要化學(xué)成分，不僅對(duì)興林抑螺和大力推廣生物措施防控血吸蟲病具有重要意義，還為利用烏桕防治血吸蟲病、定向選育高抑螺活性的烏桕品種及開(kāi)展更有效的抑螺行動(dòng)提供理論指導(dǎo)。本研究通過(guò)抑螺實(shí)驗(yàn)結(jié)合GC-MS聯(lián)用分析獲得的研究結(jié)果，對(duì)烏桕葉片的抑螺研究具有重要的參考價(jià)值。但這些已鑒定的化合物抑螺效果如何，需要通過(guò)進(jìn)一步的提純、合成以及單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯: 張明霞)

Analysis on main chemical components in oncomelania-inhibited extracts from leaf ofSapiumsebiferum

YANG Yongfeng1, SUN Qixiang2

(1. Academy of Forestry Inventory and Planning, State Forestry Administration, Beijing 100714, China; 2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 115-117

Oncomelania-inhibited component in petroleum ether extracts from leaf ofSapiumsebiferum(Linn.) Roxb. was researched by column separation technology and GC-MS method, and compound separated from leaf was identified by NIST 107 and Wiley 6.0. The results show that relative peak areas of 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, hexadecanoic acid, 9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester, 1，2-benzenedicarboxylic acid bis (2-ethylhexyl) ester and 8，11，14-eicosatrienoic acid are larger, and suggesting that they are the main oncomelania-inhibited compounds. In which, hexadecanoic acid may be one of active materials inhibiting oncomelania fromS.sebiferum. This result has an important value to extension of biological measure controlling schistosomiasis.

Sapiumsebiferum(Linn.) Roxb.; oncomelania; oncomelania-inhibited component; GC-MS

2015-03-12

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD38B07)

楊永峰(1983—)，男，安徽阜陽(yáng)人，博士，主要從事濕地保護(hù)與管理和林業(yè)生態(tài)工程方面的研究。

Q946; Q949.99

A

1674-7895(2015)03-0115-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.17