濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能的影響研究

劉瑩，周曉玲，謝勝，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能的影響研究

劉瑩，周曉玲，謝勝，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀

目的探討濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對肝硬化大鼠T淋巴細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能的影響。方法2014年10—12月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的30只肝硬化大鼠分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各15只。對照組采用單純BMSCs移植治療，實(shí)驗(yàn)組采用濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植治療。治療前及治療后1、2、3、4周檢測兩組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)。結(jié)果CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，治療方法與時(shí)間存在交互作用(P＜0．05);組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);時(shí)間間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后2、3、4周CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(RBC·C3bRR)、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(RBC·ICR)比較，治療方法與時(shí)間存在交互作用(P＜0．05);組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);時(shí)間間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后3、4周RBC·C3bRR、RBC·ICR與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)論與單純BMSCs移植相比，濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植可明顯改善肝硬化大鼠的T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能的相關(guān)指標(biāo)。

肝硬化;間質(zhì)干細(xì)胞移植;濟(jì)生腎氣湯;T淋巴細(xì)胞亞群;模型，動物

劉瑩，周曉玲，謝勝，等．濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能的影響研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(36):4501－4505．［www．chinagp．net］

Liu Y，Zhou XL，Xie S，et al．Effect of Jisheng Shenqi decoction combined with bone mesenchymal stem cells transplantation on T－lymphocyte subsets and red cell immune function of rats with liver cirrhosis［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4501－4505．

肝硬化是一種由不同病因長期作用于肝臟而引起的慢性、進(jìn)行性、彌漫性肝病。肝硬化患者早期無明顯癥狀，進(jìn)展至終末期則出現(xiàn)一系列不同程度的門靜脈高壓和肝功能障礙，直至出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病等并發(fā)癥而死亡［1］。原位肝移植是治療終末期肝病較理想的手段，但由于供體短缺、手術(shù)費(fèi)用昂貴、免疫排斥及倫理道德等諸多條件的限制，難以在臨床廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞移植是近年發(fā)展起來的一種治療終末期肝病的新技術(shù)，為解決供體肝來源的短缺開拓了新的途徑。骨髓中除造血干細(xì)胞外，還有另一類間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是源于中胚層并具有多向分化潛能的細(xì)胞，具有在不同誘導(dǎo)條件下向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化的能力［2－3］，研究人員還發(fā)現(xiàn)，MSCs在體外可分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞［4－6］。本課題組通過長期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合濟(jì)生腎氣丸能夠明顯提高骨髓MSCs(BMSCs)移植的臨床治療效果［7－8］。最新藥理研究發(fā)現(xiàn)，腎氣丸具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫及血液系統(tǒng)的作用，用環(huán)磷酰胺制造小鼠免疫抑制模型觀察腎氣丸對其免疫調(diào)節(jié)的作用，結(jié)果顯示，腎氣丸能提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高胸腺重量，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能，提高紅細(xì)胞數(shù)量［9］。而肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，如何延緩肝纖維化過程成為治療的關(guān)鍵點(diǎn)。為了探討濟(jì)生腎氣湯是如何起到配合BMSCs移植發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用從而減緩肝硬化的進(jìn)程，本研究通過設(shè)立單純BMSCs移植的對照組與濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植的實(shí)驗(yàn)組，觀察BMSCs移植治療前后兩組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能的變化，以初步闡明這一免疫調(diào)節(jié)的作用所在。

1材料與方法

1．1動物、試劑、儀器與藥物

1．1．1動物2014年10—12月選取4周齡大鼠10只，雄性，體質(zhì)量(100±5)g(提取BMSCs用);健康SPF級SD大鼠37只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g(BMSCs移植用)。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號:桂醫(yī)動字第11004號。

1．1．2試劑、儀器分離BMSCs采用低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶，均購自GIBCO公司;抗大鼠CD29－PE、抗大鼠CD34－PE、抗大鼠CD45－PE、抗大鼠CD90－PE均購自美國BioLegend公司;流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;T淋巴細(xì)胞亞群檢測采用Mouse CD4試劑盒，購自北京福瑞生物工程公司(批號:20110801);Mouse CD8試劑盒，購自西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司(批號:20080817);紅細(xì)胞免疫功能檢測采用致敏及未致敏凍干酵母菌制劑，均購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院免疫室;肝硬化大鼠模型造模采用橄欖油、四氯化碳(CCl4)溶液。

1．1．3藥物濟(jì)生腎氣湯由熟地黃80 g、山茱萸40 g、山藥40 g、澤瀉30 g、茯苓30 g、丹皮30 g、肉桂10 g、附子10 g、車前子20 g、牛膝20 g構(gòu)成。以上藥物由天津三延公司生產(chǎn)的三延牌中藥煎煮機(jī)煎煮，符合《中華人民共和國藥典(2010年版)》相關(guān)規(guī)定［10］，并由柳州市中醫(yī)院制劑室煎制。以上復(fù)方以大火煎開，文火水煎2次，過濾去渣，合并水煎液后在中藥液體包裝機(jī)中濃縮成含生藥3 g/ml溶液作為灌胃溶劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 BMSCs分離鑒定、模型制備與給藥途徑

1．2．1大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)將4周齡大鼠用異氟烷腹腔注射深度麻醉處死后，于無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，取其骨髓細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用加10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后首次換液，以后每2～3 d換液1次，7～10 d細(xì)胞生長融合，經(jīng)0．25%胰酶消化，1∶2傳代，其后一般3 d傳代1次，選取生長良好的P3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。之后分別加入抗大鼠CD29－PE、抗大鼠CD34－PE、抗大鼠CD45－PE、抗大鼠CD90－PE，同型對照，室溫避光孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面標(biāo)志物。

1．2．2肝硬化大鼠模型制備對健康大鼠腹腔注射50%的橄欖油CCl4溶液(橄欖油與CCl4的體積比為1∶1)，劑量1 ml/kg，1次/3 d，逐漸增加到2 ml/kg，根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整劑量，以體質(zhì)量不增加或者輕度降低為準(zhǔn)，注射2個月后取肝組織活檢，通過肝組織病理學(xué)證實(shí)造模成功。

1．2．3分組及給藥途徑采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的30只肝硬化大鼠分為對照組15只、實(shí)驗(yàn)組15只。對照組大鼠采用單純BMSCs移植治療:經(jīng)門靜脈注入1．5 ml約含1．5×106個的BMSCs。實(shí)驗(yàn)組采用濟(jì)生腎氣湯中藥灌胃聯(lián)合BMSCs移植治療:經(jīng)門靜脈注入1．5 ml約含1．5×106個的BMSCs;灌胃方法:在行BMSCs移植治療前后各1周，分別于每日9:00予濟(jì)生腎氣湯中藥灌胃治療，2 ml/次，2次/d，總灌胃14 d。兩組大鼠治療后均動態(tài)觀測1個月。

1．3觀察指標(biāo)及測定標(biāo)準(zhǔn)

1．3．1外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8

+檢測分別在治療前及治療后1、2、3、4周于大鼠尾部取血，肝素鈉抗凝，100μl全血加CD4+、CD8+抗體各10μl，輕輕吹勻后，避光，室溫溫育30 min，加1 ml紅細(xì)胞裂解液，1 000 r/min離心5 min(離心半徑140 mm)，棄上清液，用1 ml 0．001 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)重新懸浮細(xì)胞，200目過濾網(wǎng)過濾樣本后上機(jī)檢測，按照大鼠CD4+、CD8+試劑盒說明書，采用流式細(xì)胞儀檢測，上樣分析。從抽血采樣到分析在8 h內(nèi)完成。計(jì)算CD4+/CD8+。

1．3．2紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)檢測按常規(guī)方法操作，分別在治療前及治療后1、2、3、4周采用郭氏法［11］檢測大鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(RBC·C3bRR)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(RBC·ICR)。由于大鼠免疫細(xì)胞存在晝夜節(jié)律，故采樣時(shí)間均定于9:00。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間不同時(shí)間觀察指標(biāo)比較采用重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，不同時(shí)間間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1大鼠一般情況肝硬化造模過程中共死亡大鼠7只，存活30只。造模成功的肝硬化大鼠日常表現(xiàn)為精神差、食欲差、喜臥少動。肝硬化大鼠肝組織病理學(xué)可見假小葉形成(見圖1)。在BMSCs移植治療過程中，對照組3只大鼠因門靜脈注射BMSCs后止血不徹底而死亡;實(shí)驗(yàn)組2只大鼠因移植BMSCs后發(fā)生出血不止而死亡。對照組和實(shí)驗(yàn)組各有1只大鼠出現(xiàn)顯著的腹部膨隆，解剖腹腔發(fā)現(xiàn)大量清亮腹腔積液。

圖1造模成功的肝硬化大鼠肝臟病理圖片(HE染色，×100)Figure 1 Pathological picture of liver of rats with liver cirrhosis

2．2 BMSCs分離培養(yǎng)和鑒定結(jié)果原代培養(yǎng)的BMSCs多為不規(guī)則形狀，細(xì)胞核較大，此后貼壁生長的細(xì)胞呈集落樣生長，懸浮的細(xì)胞隨著換液逐漸被去掉，生長良好的P3代細(xì)胞呈梭狀，且細(xì)胞形態(tài)更趨于一致(見圖2)。流式細(xì)胞儀檢測表面抗原特性，結(jié)果顯示，CD34、CD45陽性率分別為0．38%、0．62%，CD29、CD90陽性率分別為97．3%、98．5%，說明傳代貼壁生長的梭形細(xì)胞是骨髓中區(qū)別于造血干細(xì)胞的另一群處于未分化狀態(tài)的非定向干細(xì)胞——BMSCs。

圖2生長良好的P3代細(xì)胞呈形態(tài)一致的梭狀Figure 2 P3'cells in well growth taking on fusiform in a consistent pattern

2．3兩組大鼠治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，治療方法與時(shí)間存在交互作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);時(shí)間間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠CD+、CD+、CD+484/CD8+與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后2、3、4周CD+、CD+、CD+484/CD8+與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表1)。

2．4兩組大鼠治療前后外周血紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較RBC·C3bRR、RBC·ICR比較，治療方法與時(shí)間存在交互作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);時(shí)間間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠治療后3、4周RBC·C3bRR、RBC·ICR與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表2)。

3討論

本研究通過對濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植治療肝硬化大鼠進(jìn)行研究，觀察治療前后大鼠的T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠的CD+、CD+、CD+484/CD8+、RBC·C3bRR明顯增高、RBC·ICR明顯下降。眾所周知，T淋巴細(xì)胞亞群在肝細(xì)胞損害、機(jī)體抗腫瘤免疫中起重要作用，其是最為活躍的免疫活性細(xì)胞之一，不僅是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞，還有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的作用。CD4+T淋巴細(xì)胞主要由Th細(xì)胞構(gòu)成，其功能可協(xié)助T、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。而CD8+T淋巴細(xì)胞主要由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和Ts細(xì)胞構(gòu)成，其不僅對B細(xì)胞合成和分泌抗體有抑制作用，而且對Th輔助作用、遲發(fā)型超敏反應(yīng)以及Tc介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用均可起到負(fù)調(diào)節(jié)作用［10］。

表1兩組大鼠治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較(x±s)Table 1 Comparison of T cell subset in the peripheral blood between the two groups before and after treatment

表2兩組大鼠治療前后外周血紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較(x±s，%)Table 2 Comparison of red blood cell immune function of peripheral blood between the two groups before and after treatment

從1981年Siegel等［11］提出紅細(xì)胞具有免疫功能的理論后，該理論受到人們的重視，并被廣泛應(yīng)用于臨床治療的療效評價(jià)體系中。紅細(xì)胞不僅具有呼吸功能，而且還參與機(jī)體的免疫防御機(jī)制。由于紅細(xì)胞數(shù)量多，其作用是白細(xì)胞無法比擬的，具有識別濃縮抗原、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能的作用，還可利用紅細(xì)胞膜上的C3b受體轉(zhuǎn)運(yùn)銷毀循環(huán)免疫復(fù)合物。紅細(xì)胞與細(xì)菌、病毒等微生物黏附后，可以通過釋放細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶直接殺傷微生物，并且促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用。此外，紅細(xì)胞不僅自身具備完整的自我調(diào)控系統(tǒng)，還參與調(diào)控機(jī)體的整體免疫功能，從而發(fā)揮其在機(jī)體固有免疫應(yīng)答中的重要作用。當(dāng)肝細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞時(shí)，肝臟合成功能減退，紅細(xì)胞免疫功能受損，其表現(xiàn)以RBC·C3bRR降低和RBC·ICR增高為主［12］;另一方面，由于肝內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能障礙，使紅細(xì)胞CRI攜帶CIC卸下轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞銷毀能力減弱。肝細(xì)胞壞死、再生和肝纖維化造成脾臟淤血，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)處于異常狀態(tài)，清除、滅活CIC能力進(jìn)一步減弱。對肝硬化大鼠的研究中，雖然肝硬化大鼠是人為藥物所致，與人體長期感染病毒所致的肝炎后肝硬化不同，但均為肝細(xì)胞遭到大面積破壞，進(jìn)而促使肝臟合成功能減退，這在一定程度上必然影響整個大鼠機(jī)體免疫功能的紊亂。本研究肝硬化大鼠雖未經(jīng)過炎癥的反復(fù)作用，但其肝功能在短期內(nèi)遭到破壞致使其免疫功能紊亂，這與整個肝臟參與整個機(jī)體的運(yùn)作是密切相關(guān)的。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植治療肝硬化大鼠，治療后RBC·C3bRR升高而RBC·ICR降低，說明BMSCs移植后肝硬化大鼠紅細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的功能得到了一定的恢復(fù)，有可能是移植后的干細(xì)胞在紅細(xì)胞免疫重建中發(fā)揮了作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植可進(jìn)一步提高治療效果。近年來，中醫(yī)藥在治療肝纖維化與肝硬化上已取得了一定的進(jìn)展，已有多個抗肝纖維化經(jīng)驗(yàn)方藥與中藥新藥問世并廣泛用于臨床，其共同闡明“正虛血瘀”為肝硬化之病機(jī)特點(diǎn)，而“扶正化瘀”則成為了中醫(yī)藥治療肝纖維化、肝硬化的基本治則［13］。正氣虧耗為久病肝硬化患者的共同特點(diǎn)，其病以“正虛”為本，且多以脾腎兩虛為主。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，濟(jì)生腎氣湯可能增強(qiáng)了干擾素α－2b治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的免疫應(yīng)答，并減少了干擾素α－2b治療的不良反應(yīng)［14］。劉靜生等［15］采用益腎升白湯方治療肝腎陰虛型失代償性肝硬化，以扶正祛邪為原則，調(diào)補(bǔ)肝腎為治法，獲得較好療效。本研究采用的濟(jì)生腎氣湯是漢代醫(yī)圣張仲景創(chuàng)制的著名方劑，該方具有填精益髓、溫陽利水功能，已被廣泛應(yīng)用于臨床?？v觀全方，以小劑溫陽藥置于10倍之滋陰利水劑之中，恰似坎卦一陽爻藏于兩陰爻之中，取象于火涵水中，藏而不露。又以山藥厚其土以藏之，山茱萸斂其氣以秘之，澤瀉、丹皮、茯苓引亢火以歸之，車前子、牛膝以消陰翳。如此則腎復(fù)其封蟄之職，水中之火，不亢不衰，緩緩蒸騰，溫養(yǎng)五臟六腑，而不蓄水。該方配伍充分體現(xiàn)了水火既濟(jì)之象，這一全新配伍從中醫(yī)上增強(qiáng)溫補(bǔ)脾腎助陽利水之效，臨床上用于久病肝硬化患者，以少量腹腔積液多見，此方在溫補(bǔ)腎陽的同時(shí)起到化濕之功效。本研究結(jié)果亦表明，濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植治療肝硬化大鼠，不僅其外周血T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)得到改善，紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)亦得到顯著改善。這表明濟(jì)生腎氣湯具有優(yōu)異的免疫調(diào)控功能，與BMSCs移植聯(lián)合運(yùn)用可起到免疫功能協(xié)同增效的作用，可能對BMSCs移植后的定植及增強(qiáng)細(xì)胞活性起到積極的調(diào)控作用。

綜上所述，筆者通過相關(guān)檢索發(fā)現(xiàn)，目前對BMSCs移植治療肝硬化的具體作用機(jī)制尚未完全明確［16－17］，在免疫相關(guān)性研究上，雖然紅細(xì)胞免疫理論近年研究呈減少趨勢，但其在肝硬化機(jī)體中的免疫功能作用是不能忽略的，本研究以外周血T淋巴細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)變化作為出發(fā)點(diǎn)，旨在初步闡明肝硬化大鼠相關(guān)免疫功能的變化。而聯(lián)合中醫(yī)藥的治療方案及相關(guān)機(jī)制的研究則更是罕見，本研究通過建立肝硬化大鼠模型，觀察兩種方案在改善大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能指標(biāo)上的不同，發(fā)現(xiàn)濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植的治療效果優(yōu)于單純BMSCs移植，且其療效指標(biāo)也比對照組要穩(wěn)定，從而初步闡明了濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植治療方案的作用機(jī)制之所在，為該療法的臨床推廣應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。但同時(shí)，本研究對濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植的具體協(xié)同機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍存在諸多不明確性，這需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步揭示，從而為肝硬化患者能獲得更好、更有效的治療提供新思路、新方法。

利益沖突聲明:本課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。無利益沖突。

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Effect of Jisheng Shenqi Decoction Combined W ith Bone M esenchym al Stem Cells Transp lantation on T－lym phocyte Subsets and Red Cell Immune Function of Rats W ith Liver Cirrhosis

LIU Ying，ZHOU Xiao－ling，XIE Sheng，et al．Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China

ObjectiveTo investigate the influence of Jisheng Shenqidecoction combined with bonemesenchymal stem cells(BMSCs)transplantation on T－lymphocyte subsets and red cell immune function of rats with liver cirrhosis．Methods From October to December in 2014，liver cirrhosismode was successfully built in 30 rats，and the ratswere divided into control group and trial group using convenience number table method with 15 in each group．Control group was administrated with only BMSCs transplantation，and trial group was administrated with Jisheng Shenqi decoction combined with BMSCs transplantation．Before treatmentand 1，2，3 and 4 weeks after treatment，the T－lymphocyte subsets and red blood cell immune function of the rats were measured．Results In the comparison of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+，interaction effect existed between treatmentmethod and time(P＜0．05);significant differences existed between the two groups(P＜0．05);significant differences existed between different time points(P＜0．05)．Before treatment，1 week and 2 weeks after treatment，control group were not significantly different(P＞0．05)from trial group in CD4+，CD8+and CD4+/CD8+;3 weeks and 4 weeks after treatment，control group and trial group were significantly different(P＜0．05)in CD4+，CD8+and CD4+/CD8+;the CD4+，CD8+and CD4+/CD8+of control group and trial group at 2 weeks，3 weeks and 4 weeks after treatment were significantly different from those before treatment(P＜0．05)．In the comparison of RBC·C3bRR and RBC·ICR，interaction effectexisted between treatmentmethod and time(P＜0．05);significant differences existed between the two groups(P＜0．05);significant differences existed between different time points(P＜0．05)．Before treatment，1 week and 2 weeks after treatment，control group were not significantly different(P＞0．05)from trial group in RBC·C3bRR and RBC·ICR;3 weeks and 4 weeks after treatment，control group and trial group were significantly different in RBC·C3bRR and RBC·ICR(P＜0．05)．Conclusion

Compared with the only use of BMSCs transplantation，BMSCs transplantation combined with Jisheng Shenqi decoction can significantly improve the T－lymphocyte subsets and red blood cell immune function of rats with liver cirrhosis．

Liver cirrhosis;Mesenchymal stem cell transplantation;Jisheng Shenqi decoction;T－lymphocyte subsets;Models，animal

R 657．31

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．021

2015－03－24;

2015－10－09)

(本文編輯:陳素芳)

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目課題(桂科攻1298003－2－10)

530001廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(劉瑩);柳州市中醫(yī)院(周曉玲，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀);廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(謝勝)

周曉玲，545001廣西柳州市中醫(yī)院;E－mail:zxl_lz@163．com