ARHI基因抑制胰腺癌細胞增殖的作用機制研究

路新卿，楊紅，李景南，胡益群，錢家鳴

·論著·

ARHI基因抑制胰腺癌細胞增殖的作用機制研究

路新卿，楊紅，李景南，胡益群，錢家鳴

目的觀察ARHI基因對胰腺癌細胞增殖的影響，探討其抑制細胞增殖的機制。方法2009年3—9月人胰腺癌細胞株PANC－1選自北京協(xié)和醫(yī)院，根據(jù)轉入質粒將培養(yǎng)細胞分為Control組(無轉染質粒的PANC－1細胞)、Vector組(穩(wěn)定表達pIRES2－EGFP質粒的PANC－1細胞)、ARHI組(穩(wěn)定表達pIRES2－EGFP－ARHI質粒的PANC－1細胞)。通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法分析3組胰腺癌細胞在培養(yǎng)第0、1、2、3、4、5天增殖情況;應用流式細胞儀檢測3組胰腺癌細胞周期;通過Western blotting法檢測3組ARHI、磷酸化絲氨酸蛋白激酶(p－AKT)、MDM2、p53、p21WAF1、絲氨酸蛋白激酶(AKT)表達;應用碘化丙啶(PI)－3K/AKT抑制劑LY294002干預ARHI組，檢測ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表達。結果3組培養(yǎng)第1、2、3、4、5天細胞增殖情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。Vector組培養(yǎng)第4、5天細胞增殖情況與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);ARHI組培養(yǎng)第1、2、3、4、5天細胞增殖情況與Control組和Vector組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。3組細胞周期比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。Vector組G0－G1期、S期細胞所占比例與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);ARHI組G0－G1期、S期細胞所占比例與Control組和Vector組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);ARHI組G2－M期細胞所占比例與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。與Control組和Vector組相比，ARHI組p－AKT、MDM2表達降低，p53、p21WAF1表達增多，而AKT表達沒有變化;ARHI組加入LY294002與未加入LY294002相比，p－AKT、MDM2表達降低，p53、p21WAF1表達增加，而ARHI、AKT表達沒有變化。結論ARHI基因通過抑制PI－3K/AKT/MDM2，導致p53、p21WAF1表達上調，在胰腺癌發(fā)生中起著重要的作用。

胰腺腫瘤;細胞增殖;PI－3K/AKT通路;ARHI基因;細胞周期

路新卿，楊紅，李景南，等．ARHI基因抑制胰腺癌細胞增殖的作用機制研究［J］．中國全科醫(yī)學，2015，18 (36):4455－4458．［www．chinagp．net］

Lu XQ，Yang H，Li JN，et al．Mechanism of ARHIgene in inhibiting pancreatic cancer cell proliferation［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4455－4458．

胰腺癌發(fā)生率較低，但其病死率很高，胰腺癌占新發(fā)癌癥的3%，但其引起的病死率占癌癥死亡原因的第4位［1］。預期到2030年，其將升至為癌癥死亡原因的第2位［2］。由于胰腺癌早期診斷困難，手術治療后長期生存率低，故降低胰腺癌的病死率，必須做到早期診斷、早期治療。因此，從基礎研究中發(fā)現(xiàn)胰腺癌早期診斷的線索是目前研究的方向之一。ARHI基因是一個抑癌基因，屬于Ras家族，具有抑制細胞生長、促進細胞凋亡和抑制細胞遷移的作用，在人體很多腫瘤組織低表達或者表達缺失，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用［3－4］。前期研究表明，ARHI基因在胰腺癌中表達缺失，具有促進細胞凋亡的作用［5］。本研究探討ARHI基因對胰腺癌細胞增殖的影響并對其機制進行研究，以期為臨床研究奠定基礎。

1材料與方法

1．1細胞和試劑人胰腺癌細胞株PANC－1(北京協(xié)和醫(yī)院)，細胞培養(yǎng)試劑(Gibco，USA)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)細胞增殖檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，蛋白提取試劑(北京全式金生物有限公司)，Western blotting實驗試劑(普利萊基因技術有限公司)，細胞周期檢測試劑〔RNA酶、碘化丙啶(PI)〕(Sigma，USA)，ARHI兔抗人多克隆抗體和ARHI小鼠抗人單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，β－Actin兔抗人多克隆抗體(Santa Cruze，美國)，絲氨酸蛋白激酶(serine－threonine kinase，AKT)、磷酸化絲氨酸蛋白激酶(phospho－serine－threonine kinase，p－AKT)兔抗人多克隆抗體(Cell Sigalling Technology，USA)，p53兔抗人多克隆抗體(Santa Cruze，USA)，p21WAF1兔抗人多克隆抗體(Sigma，USA)，MDM2兔抗人多克隆抗體(Sigma，USA)，PI－3K/AKT抑制劑LY294002(Sigma，USA)，p IRES2－EGFP質粒、p IRES2－EGFP－ARHI質粒(北京協(xié)和醫(yī)院消化內科實驗室)。

1．2穩(wěn)定轉染胰腺癌細胞株的建立和培養(yǎng)2009年3—9月應用瞬時轉染法分別對PANC－1細胞轉染p IRES2－EGFP質粒(作為對照)和pIRES2－EGFP－ARHI質粒，在48 h時加入新霉素(PANC－1為900 μg/m l)進行篩選，每天倒置顯微鏡下和熒光顯微鏡下觀測。每天換用新的培養(yǎng)基以及新霉素，維持篩選壓力。第14天時，熒光顯微鏡下可見散在綠色熒光細胞，即成功建立了穩(wěn)定表達ARHI基因和空載體的胰腺癌細胞株，以后每2～3 d換用新的培養(yǎng)基及新霉素。穩(wěn)定轉染的胰腺癌細胞株中ARHI基因和蛋白表達鑒定見文獻［5］，細胞培養(yǎng)于DMEN培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3 d換用新鮮培養(yǎng)基。

1．3細胞分組Control組:無轉染質粒的PANC－1細胞;Vector組:穩(wěn)定表達pIRES2－EGFP質粒的PANC－1細胞;ARHI組:穩(wěn)定表達pIRES2－EGFP－ARHI質粒的PANC－1細胞。

1．4細胞增殖檢測應用MTT法檢測3組細胞增殖情況。應用移液器將Control組、Vector組、ARHI組細胞分別加入96孔板不同的3排〔每孔中加入細胞懸液100 μl(1×104個胰腺癌細胞)〕進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)第0、1、2、3、4、5天測定3組細胞吸光度(optical density，OD值);在進行每個時間點測定之前，每孔每100μl培養(yǎng)基加入10μl MTT Stock，繼續(xù)溫育4 h;吸除培養(yǎng)基后，在每孔中加入100μl MTT溶解劑，在37℃培養(yǎng)箱內繼續(xù)溫育4 h;應用酶標儀在570 nm處測定OD值，實驗重復5次，取平均值。

1．5細胞周期檢測應用流式細胞儀檢測3組細胞周期。應用培養(yǎng)基將胰腺癌細胞消化成單細胞懸液后，應用70%乙醇溶液固定細胞，4℃過夜;第2天離心(200×g，離心10 min)，去掉乙醇固定液，在細胞中加入RNA酶溶液，在37℃條件下溫育20 min后，應用冰浴終止RNA酶的作用;再加入PI染液，置于4℃避光染色40 min;應用流式細胞儀測定細胞在各周期所占比例，實驗重復5次，取平均值。

1．6 LY294002的配制及應用在潔凈臺中向LY294002試劑瓶中加入二甲基亞砜(DMSO)581．7μl，配成500 μmol/L存儲液，4℃保存，使用時溶解，以1/100體積加入ARHI表達的細胞培養(yǎng)基中，應用LY294002抑制細胞12 h后，終止實驗，提取蛋白。

1．7蛋白提取方法同筆者前期研究［5］。

1．8蛋白檢測采用Western blotting法進行蛋白檢測。制備十二烷基硫酸鈉(SDS)－聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)，樣品變性及電泳，轉膜，封閉、抗體孵育及曝光。檢測ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表達情況。然后應用LY294002(50μmol/L)處理ARHI組細胞檢測ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表達情況。

1．9統(tǒng)計學方法應用SPSS 11．5統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1 3組培養(yǎng)不同時間點細胞增殖情況比較3組培養(yǎng)第1、2、3、4、5天細胞增殖情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。Vector組培養(yǎng)第4、5天細胞增殖情況與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。ARHI組培養(yǎng)第1、2、3、4、5天細胞增殖情況與Control組和Vector組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表1)。

2．2 3組細胞周期比較3組細胞周期比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。Vector組G0－G1期、S期細胞所占比例與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。ARHI組G0－G1期、S期細胞所占比例與Control組和Vector組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。ARHI組G2－M期細胞所占比例與Control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表2)。

2．3蛋白檢測與Control組和Vector組相比，ARHI組p－AKT、MDM2表達降低，p53、p21WAF1表達增多，而AKT表達沒有變化(見圖1A)。ARHI組加入LY294002與未加入LY294002相比，p－AKT、MDM2表達降低，p53、p21WAF1表達增加，而ARHI、AKT表達沒有變化(見圖1B)。

3討論

在西方國家，胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，其病死率占惡性腫瘤的第4位［6］，在我國胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第5～7位［7］。有研究報道，胰腺癌患者1年存活率低于20%，5年存活率僅為3%［8］。胰腺癌的發(fā)病率與病死率十分接近，預后非常差［8］。因此，應加強胰腺癌基因和分子水平的研究，以提高胰腺癌的診治水平。

在腫瘤細胞周期調控過程中，抑癌基因或其產物發(fā)揮了重要作用。ARHI基因是在正常胰腺上皮細胞表達而在胰腺癌中表達缺失的抑癌基因，該基因可以抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、激活c－Jun信號轉導通路［3，9］。ARHI基因在乳腺癌中可以上調p21WAF1表達和下調cyclin D1啟動子的活性。故本研究對ARHI基因抑制胰腺癌細胞增殖的機制進行了研究。

表2 Control組、Vector組及ARHI組細胞周期比較(x±s，%，n=5)Table 2 Comparison of cell cycle among the three groups

圖1蛋白表達電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of protein expression

表1 Control組、Vector組及ARHI組培養(yǎng)不同時間點細胞增殖情況比較(±s，n=5)Table 1 Comparison of cell proliferation at different time points among the three groups

表1 Control組、Vector組及ARHI組培養(yǎng)不同時間點細胞增殖情況比較(±s，n=5)Table 1 Comparison of cell proliferation at different time points among the three groups

注:與Control組比較，aP＜0．05;與Vector組比較，bP＜0．05

組別第0天第1天第2天第3天第4天第5天Control組0．040±0．010 0．070±0．006 0．210±0．039 0．350±0．070 0．580±0．090 1．201±0．163 Vector組0．043±0．004 0．058±0．006 0．190±0．014 0．317±0．023 0．490±0．050a0．710±0．080aARHI組0．048±0．001 0．046±0．003ab0．060±0．013ab0．093±0．011ab0．118±0．006ab0．186±0．023abF 值＞0．05＜0．01＜0．01＜0．01＜0．01＜0．01 1．52 13．29 33．27 49．74 44．06 58．21 P值

本研究觀察了穩(wěn)定表達ARHI基因的胰腺癌細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)ARHI組第1、2、3、4、5天細胞增殖低于Control組和Vector組，而Vector組第4、5天細胞增殖低于Control組，提示ARHI組細胞增殖減慢，抑制細胞增殖較明顯。有研究表明，ARHI作為抑癌基因，可以明顯抑制細胞的生長［3］，本研究結果與之一致。同時，為了更充分地研究ARHI基因的抑癌作用，本研究應用流式細胞儀檢測了ARHI基因對胰腺癌細胞周期的影響，細胞周期分為4個時相:G1期、S期、G2期和M期，許多影響細胞增殖的調控均發(fā)生在G1期。本研究結果顯示，與Control組和Vector組相比，ARHI組G0－G1期細胞所占比例較高，S期細胞所占比例較低，而Vector組和ARHI組G2－M期細胞所占比例無差異，說明ARHI基因可以導致細胞分裂減慢或停止分裂，細胞周期表現(xiàn)為G1期停滯和DNA合成期S期的減少。

PI－3K/AKT信號轉導通路參與了許多信號轉導通路的調節(jié)，并且對腫瘤中許多異常調節(jié)的過程有深遠影響，在調節(jié)胰腺癌細胞生長和增殖方面起著重要作用［10－11］。因為ARHI基因屬于Ras超家族，PI－3K/AKT信號轉導通路屬于Ras超家族經典信號轉導通路之一［12］，所以筆者重點研究了ARHI基因是否可通過抑制PI－3K/AKT信號轉導通路進而發(fā)揮抑癌作用。本研究結果顯示，與Vector組比較，ARHI組p－AKT表達減少，而AKT表達沒有明顯變化。ARHI基因調控腫瘤細胞周期，抑制了PI－3K/AKT信號轉導通路，從而阻滯G1期向S期進行。因此，ARHI基因抑制細胞增殖，導致細胞周期停止，與PI－3K/AKT信號轉導通路有密切關系，為后續(xù)臨床研究奠定了基礎。

PI－3K/AKT信號轉導通路下游有多個作用位點，其中MDM2是該通路下游的一個重要效應分子(PI－3K/AKT/MDM2)［13］，其可以與p53結合，負向調控p53，而p53是參與調節(jié)細胞周期、控制細胞增殖和凋亡的中樞性調節(jié)因子。DNA損傷檢查點作用于細胞周期3個階段，其中G1期/S期交界處的DNA損傷檢查點由“p53途徑”控制，而p53是DNA損傷檢查點的關鍵因子［14］，當DNA損傷或衰老時，信號轉導引起轉錄因子p53累積，從而誘導細胞周期依賴的蛋白激酶(CDK)抑制p21WAF1的轉錄增強，再與cyclin－CDK復合物結合，抑制CDK活性，進而抑制細胞增殖，導致細胞周期停滯［15］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，ARHI基因轉染胰腺癌細胞后，能夠明顯下調p－AKT和MDM2的表達，而p53表達明顯增加，后者誘導p21WAF1表達上調，與Vector組相比有明顯的改變。為了證實ARHI基因是否通過PI－3K/AKT/MDM2發(fā)揮作用，筆者應用LY294002干預ARHI表達的胰腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)應用LY294002后，p－AKT、MDM2表達下調，同時上調了p53和p21WAF1的表達，提示ARHI基因抑制胰腺癌細胞增殖是通過PI－3K/AKT信號轉導通路進行的，同時也說明與p53和p21WAF1的表達增加有關。

總之，ARHI基因作為抑癌基因，可以明顯抑制胰腺癌細胞的生長，使細胞周期停滯G1期，這與PI－3K/AKT/MDM2/p53信號轉導通路有直接關系，表明ARHI基因在胰腺癌發(fā)生中起著重要作用，為進一步臨床研究提供借鑒。但本研究僅在細胞水平探討了ARHI基因的抑癌作用，后續(xù)實驗還需要進行ARHI基因在動物和臨床方面的研究。

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M echanism of ARHIGene in Inhibiting Pancreatic Cancer Cell Proliferation

LU Xin－qing，YANG Hong，LI Jing－nan，et al．Chinese Academy of Medical Sciences，Department of Gastroenterology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate impact of ARHI gene on the proliferation of pancreatic cancer cells and the mechanism of ARHIgene in inhibiting cell proliferation．M ethods From March to September in 2009，the study selected human pancreatic cancer cell lines from Peking Union Medical College Hospital，and divided them into three groups:Control group (PANC－1 cells without plasmid transfection)，Vector group(PANC－1 cells with stable expression of p IRES2－EGFP plasmid)，ARHIgroup(PANC－1 cells with stable expression of pIRES2－EGFP－ARHI plasmid)．Using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)method，the proliferation of these pancreatic cancer cells on day 0，day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5 were analyzed;flow cytometry was applied to detect cell cycle;using western blotting method，the expression levels of ARHI，p－AKT，MDM2，p53，p21WAF1and AKT of the three groups were detected;PI－3K/AKT inhibitor LY294002 was used to conduct intervention on ARHI group，and the expression levels of ARHI，p－AKT，MDM2，p53，p21WAF1and AKT were detected．Results The three groupswere significantly different in cell proliferation on day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5(P＜0．05)．Vector group and Control group were significantly different in cell proliferation on day 4 and day 5(P＜0．05);ARHI group was significantly different from Control group and Vector group in the cell proliferation on day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5(P＜0．05)．The three groupswere significantly different in cell cycle(P＜0．05)．Vector group and Control group were significantly different in the cell proportion in stage G0－G1and stage S(P＜0．05);ARHIgroup was significantly different fromControl group and Vector group in stage G0－G1and stage S(P＜0．05);ARHI group and Control group were significantly different in cell proportion in stage G2－M(P＜0．05)．Compared with Control group and Vector group，the expression levels of p－AKT and MDM2 decreased and the expression levels of p53 and p21WAF1increased，while the expression level of AKT had no change in ARHI group;after the ARHI group was added inhibitor LY294002，the expression levels of p－AKT and MDM2 decreased，and the expression levels of p53 and p21WAF1increased，while the expression levels of ARHI and AKT had no change．Conclusion ARHIgene improves the expression levels of p53 and p21WAF1by inhibiting PI－3K/AKT/MDM2 passage and plays an important part in the occurrence of pancreatic cancer．

Pancreatic neoplasms;Cell proliferation;PI－3K/AKT;ARHIgene;Cell cycle

R 735．9

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．011

2015－10－20;

2015－11－11)

(本文編輯:李婷婷)

國家自然科學基金資助項目(30670963);河北省科技支撐計劃項目(13277744D，14277735D)

100730北京市，中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)院消化內科

錢家鳴，100730北京市，中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)院消化內科;E－mail:qianjiaming1957@126．com