沙門菌T3SS相關(guān)效應(yīng)蛋白作用機制的研究進展

湯佩佩，藺志杰，潘志明，焦新安

沙門菌T3SS相關(guān)效應(yīng)蛋白作用機制的研究進展

湯佩佩，藺志杰，潘志明，焦新安

沙門菌是人獸共患病原菌，能感染宿主并導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥和死亡。沙門菌的致病性主要是由沙門菌SPI-1和SPI-2編碼的T3SS的效應(yīng)蛋白相互作用的結(jié)果。本文主要對T3SS相關(guān)效應(yīng)蛋白在沙門菌感染的不同階段發(fā)揮的功能進行綜述，以期為進一步了解沙門菌致病機理提供參考。

沙門菌；T3SS效應(yīng)蛋白；功能

沙門菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性致病菌，能引起食物中毒、腸胃炎、傷寒和敗血癥等[1]。鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)是常見食源性病原菌之一，其在感染動物和人的癥狀頗為相似，感染鼠傷寒沙門菌臨床上多表現(xiàn)為胃腸炎癥狀。盡管沙門菌引起的腹瀉及炎癥的發(fā)病機理已被廣泛研究，但是沙門菌如何長期調(diào)節(jié)宿主細胞的機制尚且不清楚。細菌的致病性是由毒力因子所決定的，不同的毒力基因組成的基因簇即為毒力島(pathogenicity islands)。沙門菌含有5個毒力島(SPI1-5)，且至少包括60個毒力基因[2]。細菌的致病性與細菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion / translocation systems，T3SS)有關(guān)。T3SS是一個由膜內(nèi)/外蛋白組成的多組份跨膜通道，其結(jié)構(gòu)類似“注射器”。其主要功能是負責效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運，通過改變宿主細胞的生理機制來促進細菌的侵入與存活。鼠傷寒沙門菌編碼兩個毒力島，即SPI-1和SPI-2。由SPI-1和SPI-2編碼的T3SS是沙門菌致病性重要的毒力因子，不同T3SS效應(yīng)蛋白在沙門菌致病的各個階段發(fā)揮不同的功能。因此本文主要選擇以鼠傷寒沙門菌為模型，對沙門菌相關(guān)T3SS效應(yīng)蛋白在感染的不同階段中發(fā)揮的功能進行了闡述，以期更好地了解沙門菌的致病機理，為沙門菌的防御和控制研究提供更多的信息。

1 依賴SPI-1T3SS的侵襲過程

與大多數(shù)革蘭氏陰性菌一樣，鼠傷寒沙門菌不僅具有內(nèi)化作用(internation)還具有侵入非吞噬細胞的能力，即沙門菌介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。這種內(nèi)化和內(nèi)吞作用都需要許多效應(yīng)蛋白的參與，如Ssp蛋白家族的SipABCD、SopB、SopE、SopE2等。這些效應(yīng)蛋白能夠介導(dǎo)肌動蛋白重塑，導(dǎo)致細胞膜內(nèi)陷以及吞噬體膜與目標顆粒結(jié)合。一旦細菌進入細胞，便伴隨著宿主細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化，進而影響一系列重要的生理生化進程，如膜的轉(zhuǎn)運、抗原的遞呈、細胞因子的產(chǎn)生、細胞分裂、凋亡以及微生物的清除等。這種沙門菌與宿主之間復(fù)雜的相互作用，將決定沙門菌在宿主內(nèi)的命運。

沙門菌SipA蛋白是由SPI-1 T3SS編碼的，是一種雙重功能的蛋白，具有誘導(dǎo)細胞骨架重排、參與細菌侵襲、進入細胞的功能。其C端能結(jié)合和綁定F-肌動蛋白且可以加強T-絲束蛋白的活性，導(dǎo)致膜內(nèi)陷，促進細菌進入宿主細胞。而其N端含有激活上皮細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能結(jié)構(gòu)域，這個通路會促進中性粒細胞的跨膜遷移[3]。

SopB是一種依賴T3SS分子伴侶的效應(yīng)蛋白，具有磷酸肌醇磷酸酶活性，可以水解磷酸肌醇和肌醇磷酸鹽，引起宿主細胞產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。沙門菌分泌SopB蛋白首先作用于細胞膜，激活小分子GTPase，如Cdc42，參與肌動蛋白的重塑。研究表明，SopB與Cdc42通過模擬真核生物的CRIB(Cdc42 and Rac-interactive binding)樣的基序特異性的結(jié)合[4]，從而進一步活化肌動蛋白核化調(diào)節(jié)因子-Arp2/3(Actin related protein2/3，ArP2/3)[5]，促進肌動蛋白的多聚化，誘導(dǎo)沙門菌膜骨架重排，促進細菌進入宿主細胞。

與SipA/C、SopB不同的是，SopE和SopE2不具有綁定肌動蛋白的功能，但它們具有鳥氨酸交換因子(Guanine nucleotide exchange factor，GEF)的功能。這個家族的效應(yīng)蛋白都含有一個保守的W-XXX-E(Trp-X-X-X-Glu)序列模體[6]，可直接激活小分子GTPAase，如Rac1和Cdc42。作為一種分子開關(guān)，SopE和SopE2的催化區(qū)域是一個可適當彎曲的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，利用氨基酸殘基和酸性側(cè)鏈，將GTPase與GDP結(jié)合的狀態(tài)置換成與GTP結(jié)合狀態(tài)并激活宿主的小分子GTPase[7]，從而激活下游信號通路，如介導(dǎo)肌動蛋白細胞骨架的重排。SopE和SopE2在基因序列上有70%的同源性，但是它們卻具有不同的底物：SopE可以作用于Rac1和Cdc42，而SopE2似乎只特異性的作用于Cdc42。

SptP是由SPI-1 TTSS編碼的效應(yīng)蛋白，具有耐高溫和耐鹽性[8]，它的分泌需要分子伴侶SicP的協(xié)助[9]。一旦沙門菌進入細胞，SptP將下調(diào)Cdc42和Rac-1，導(dǎo)致細胞膜褶邊的終止和逆轉(zhuǎn)，從而介導(dǎo)宿主細胞的細胞骨架恢復(fù)到靜息狀態(tài)。SptP與SopE是一對功能相反的蛋白，N端含有GTP酶活化蛋白(GTPAase active protein，GAP)結(jié)構(gòu)，能夠促進GTPAase與GDP結(jié)合，從而加速其水解，最終使得細胞膜骨架重排。

2 沙門菌效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的SCV的形成以及胞內(nèi)存活

沙門菌進入宿主細胞后，在胞漿內(nèi)形成一種膜泡結(jié)構(gòu)，即SCV泡(Salmonella containing vacuole，SCV)。SCV是沙門菌在細胞內(nèi)存活和不斷增殖的重要結(jié)構(gòu)。它的形成和成熟包括三個階段：早期、中期和晚期。早期的SCV膜表面集聚有許多的初級內(nèi)體膜標記蛋白EE，接著EE就會被溶酶體相關(guān)膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein 1，LAMP-1)所替代。在隨后的1～2 h內(nèi)SCV會從細胞邊緣轉(zhuǎn)移到中心粒附近。4～6 h后細菌開始在胞內(nèi)復(fù)制，并伴有沙門菌誘導(dǎo)纖絲(Sifs)開始從SCV表面輻射延伸[10]。

在SCV形成早期，T3SS-1效應(yīng)蛋白SopB發(fā)揮磷酸肌醇磷酸酯酶的活性將宿主細胞的Rab5招募至吞噬體膜上，從而刺激PI(3)P(3-磷酸酯酰肌醇)的生成以及活化Akt激酶信號級聯(lián)通路并促進LAMP-1向SCV的轉(zhuǎn)移[11]。在早期SCV形成過程中，SopB促使SNX1在細菌周圍形成一種管狀網(wǎng)織結(jié)構(gòu)，并與SNX2共同運輸M6PR(甘露糖6磷酸受體)到外側(cè)高爾基體網(wǎng)絡(luò)[12]。SopB還介導(dǎo)SNX3的形成[13]。SNX1、SNX2和SNX3即分類連接蛋白(sorting nexin，SNXs)含有PX(phoxhomology)區(qū)域，可與PI(3)P相互作用，在胞內(nèi)運輸過程中發(fā)揮著重要的作用。一旦將SNX3敲除，便抑制了LAMP-1向SCV的遷移，因此SNXs是SCV成熟的重要條件。SopB不僅可定位于細胞膜表面，促進細胞骨架重排，協(xié)助細菌侵襲，而且還能抑制溶酶體與SCV膜的融合。如圖1所示，一旦敲除SopB，沙門菌不但無法利用Rab5及PI(3)P促進SCV的完全成熟，并且還會減少初生SCV膜表面的電荷，導(dǎo)致細胞內(nèi)吞噬作用相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白如(Rab8b、13、23、35)無法從膜表面解離，從而無法抑制溶酶體與SCV膜的融合[14]。因此，SopB對細菌避免溶酶體的溶解及促進細菌在胞內(nèi)的存活具有重要的意義。

圖1 SopB抑制溶酶體與SCV的融合[14]

另外，在SCV逃避溶酶體降解的過程中一些蛋白也同樣發(fā)揮了重要的作用，如Rab9、Rab14和Rac1等。應(yīng)用相應(yīng)的siRNA沉默Rab9、Rab14與Rac1之后，SCV的成熟時間將大大延遲[15]。然而有一些T3SS-2效應(yīng)蛋白也參與了SCV的生成與成熟，如SifA。SifA可誘導(dǎo)Sifs的形成以及在沙門菌內(nèi)化后維持SCV的穩(wěn)定。SifA能與SKIP(SifA與驅(qū)動蛋白結(jié)合蛋白)結(jié)合，對于SCV的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)SCV內(nèi)細菌的位置與增殖是必不可少的[16]。

除了SifA，T3SS-2編碼的效應(yīng)蛋白SseG、SseF及SseJ在SCV的穩(wěn)定及定位過程中也發(fā)揮了重要的作用。特別是SseJ，它具有膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性，能夠促進SCV在高爾基體上的定位以及促進Sifs的形成，這對于細菌的復(fù)制是非常重要的[17]。研究發(fā)現(xiàn)SipA的N端還具有定位功能，可以與SifA共同參與SCV的生物合成和成熟進而確保它在細胞核附近的定位[3]。

總之，T3SS-1和T3SS-2編碼的效應(yīng)蛋白在SCV成熟及定位方面發(fā)揮了重要的功能，這為細菌在SCV里復(fù)制和增殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境。

3 沙門菌效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)與細胞調(diào)亡

沙門菌進入細胞后，會通過T3SS-1編碼的效應(yīng)蛋白激發(fā)宿主一系列的促炎癥反應(yīng)以及調(diào)控細胞的凋亡。而宿主細胞的凋亡又能造成細菌的免疫逃逸。另外，還有一些效應(yīng)蛋白能延長細菌在細胞內(nèi)存活，給細菌營造一個良好的生存環(huán)境。

效應(yīng)蛋白SopE與其同源的SopE2均能刺激腸道上皮細胞導(dǎo)致炎癥和腹瀉，同時還可以激活Rho家族的GTPases，從而觸發(fā)Erk、JNk和p38MAPK等信號通路，這些蛋白會激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB。NF-κB能釋放趨化因子IL-8，進而促進炎癥細胞的趨化和細胞增殖。最近有研究報道沙門菌SopE效應(yīng)蛋白激活小分子GTPase引發(fā)NF-κB級聯(lián)信號通路的過程需要NOD1參與[18]。除此之外，SopE還能利用Cdc42和Rac-1活化基質(zhì)細胞的caspase-1的活性，釋放IL-1和IL-18，從而引起黏膜炎癥反應(yīng)[19]

一旦宿主細胞信號通路被激活，細胞內(nèi)環(huán)境會發(fā)生改變，將會抑制細菌在宿主內(nèi)的存活和復(fù)制。然而，沙門菌卻進化了一些能夠克服不利環(huán)境的效應(yīng)蛋白，如SptP。其C端含有一個蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域(PTPase)，這個結(jié)構(gòu)域可幫助沙門菌在SCV里復(fù)制[20]。有研究顯示，SptP可以抑制肥大細胞脫粒，進一步抑制嗜中性粒細胞的募集，阻止血管內(nèi)容物流進感染部位，最終導(dǎo)致細菌的傳播，從而引起細菌的全身性感染[8]。作為一種GAP，SptP能結(jié)合小分子GTPases并加速其水解，抑制其活性，進而抑制ERK/MAPK酶的活性最終下調(diào)MAPK信號通路。

圖2 AvrA激活β-catenin/Wnt信號通路[23]

AvrA是SPI-1 T3SS的效應(yīng)蛋白之一，普遍存在于沙門菌和大腸桿菌中。鼠傷寒沙門菌效應(yīng)蛋白AvrA具有多種酶的功能，它在抑制炎癥、調(diào)控細胞凋亡、促進細胞增殖等方面都具有重要的作用。AvrA主要通過調(diào)節(jié)JNK MAPK、NF-κB和β-catenin/Wnt三個宿主細胞內(nèi)的信號通路來調(diào)節(jié)宿主的生理生化反應(yīng)。其中，AvrA作為一種乙?；D(zhuǎn)移酶可以磷酸化MKK4和MKK7從而下調(diào)JNK的表達，并且AvrA還能抑制TNFα的活性，抑制細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的增加，促進了JNK的磷酸化，最終導(dǎo)致其失活并阻止被感染的巨噬細胞凋亡和細菌的快速傳播[21]。AvrA還具有泛素化酶的功能，可作用于NF-κB，阻止NF-κB p65亞基的入核。另外，AvrA還能通過泛素連接酶E3阻止IκBα的去泛素化，抑制了IκBα的降解。而IκBα的降解和去泛素化是NF-κB通路引發(fā)炎癥的必要條件[22]。因此，AvrA通過抑制NF-κB信號通路，最終抑制宿主的炎癥反應(yīng)，延長細菌在胞內(nèi)的存活。另外，有研究證實AvrA可以調(diào)控β-catenin/Wnt通路。如圖2所示：AvrA能夠持續(xù)增強β-catenin的乙?；土姿峄瑢?dǎo)致乙?；土姿峄摩?catenin轉(zhuǎn)移到核上，從而激活Wnt信號通路，最終導(dǎo)致細胞增殖[23]。除此之外，NF-κB和β-catenin兩個通路之間的相互作用也會影響宿主細胞的炎癥反應(yīng)，即活化的β-catenin可以抑制NF-κB的活性，間接穩(wěn)定IκBα，抑制IL-8的分泌從而抑制炎癥的發(fā)生[24]。

4 展 望

在細菌感染過程中，由SPI-1和SPI-2編碼的沙門菌效應(yīng)蛋白具有引發(fā)細胞膜結(jié)構(gòu)重排、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及調(diào)控細胞凋亡等重要的功能。因此，這些效應(yīng)蛋白在細菌致病過程中的功能仍然是當今研究熱點，但大多以鼠傷寒沙門菌為模型，而其他血清型沙門菌效應(yīng)蛋白的致病機理還有待進一步探究。隨著人類對各種血清型沙門菌致病機理的深入研究，沙門菌病將得會到更好的防御和控制。

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Research progress on T3SS relative effector protein ofSalmonella

TANG Pei-pei,LIN Zhi-jie,PAN Zhi-ming,JIAO Xin-an

(KeyLaboratoryofZoonosesinJiangsuProvince,JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Salmonellais a pathogenic bacteria to human and animals, which can cause seriously complication and death.Salmonellapathogenicity is from the reactions of SP-1 and SP-2 T3SS effector proteins. In this paper, the functions of different T3ss effector proteins in different infection periods is reviewed to provide a reference for further understanding the pathogenesis mechanisms ofSalmonella.

Salmonella; T3SS effector proteins; functions

Pan Zhi-ming, Email: zmpan@yzu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.019

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潘志明，Email: zmpan@yzu.edu.cn

揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009

R378.2

A

1002-2694(2015)03-0277-04

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2014-09-29；

2014-12-05