水通道蛋白-5對結直腸癌淋巴結轉移的作用及機制

呂柏楠 石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓

水通道蛋白-5對結直腸癌淋巴結轉移的作用及機制

呂柏楠 石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓

目的:檢測水通道蛋白-5(AQP-5)在結直腸癌中的表達情況，分析TAZ與腫瘤淋巴結轉移情況及患者預后的關系;同時檢測腫瘤侵襲轉移蛋白金屬基質蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白的表達，并對其意義進行分析。方法收集98例區(qū)域淋巴結轉移陽性的結直腸癌及40例癌旁正常組織石蠟組織標本，免疫組化(SP)染色檢測AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達情況。記錄患者的臨床資料并進行隨訪，分析AQP-5對結直腸癌淋巴結轉移及預后的意義，并對AQP-5與腫瘤侵襲轉移蛋白的關系進行分析。結果AQP-5、MMP-2、MMP-9在腫瘤組織中表達高于癌旁組織，TIMP-1、TIMP-2表達則低于癌旁組織(P＜0.05)。AQP-5、MMP-2蛋白表達水平均與淋巴結轉移數目呈正相關(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，AQP-5陽性者生存期較短(P＜0.05)。在結直腸癌組織中AQP-5與MMP-2、MMP-9、TIMP-1之間均有相關性(P＜0.05)。結論AQP-5蛋白可促進結直腸癌的淋巴結轉移，AQP-5陽性是患者預后較差的標志。AQP-5的這種作用可能是通過調節(jié)侵襲轉移蛋白實現的。

結直腸癌;水通道蛋白-5;轉移，淋巴結;預后;侵襲轉移蛋白

近年來我國結直腸癌的發(fā)病率及死亡率不斷升高，嚴重危害人們健康。腫瘤的淋巴結轉移是導致結直腸癌進展的主要原因之一，但迄今導致結直腸癌轉移的機制還沒有完全闡明。確定轉移調控基因對結直腸癌的病情判斷及診治意義重大。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類存在于細胞膜上的膜轉運蛋白，AQP-5即為其中成員之一。研究發(fā)現AQP-5與肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤有關［1－3］，在結直腸癌中也存在異常表達［4］，但臨床意義及作用機制報道不多。在腫瘤細胞的轉移過程中，金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族發(fā)揮了重要作用［5，6］。本研究檢測了AQP-5及MMPs家族中主要成員MMP-2、MMP-9及其抑制物金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)、TIMP-2的表達，分析了AQP-5在結直腸癌的臨床及預后意義，并分析了AQP-5與MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在腫瘤中的關系，探討了AQP-5在結直腸癌淋巴結轉移過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料2011年4月至2012年3月于我院手術切除的結直腸癌組織石蠟標本98例，術后病理證實其中62例伴有區(qū)域淋巴結轉移。所有病例術前均未行放療和化療?；颊呔型暾呐R床及隨訪資料?；颊咧心?6例，女32例;年齡33～76歲，平均年齡(58.2±16.8)歲。以40例結腸鏡檢查及其他手術中獲得的正常結直腸黏膜組織石蠟標本為對照。AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9兔抗人多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產品，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物公司。

1.2 免疫組化方法及結果判斷厚約4 μm的石蠟切片脫蠟水化后嚴格按照免疫組化(SP法)試劑盒說明書進行操作。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS為陰性對照。根據組織陽性細胞百分比和染色強度綜合評分，隨機取10個400×高倍鏡視野，每視野計數100個細胞。AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2以細胞質或細胞膜出現棕黃色顆粒為染色陽性。計分方法:無陽性細胞計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。染色強度計分:未著色0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。根據樣本陽性細胞百分比和染色強度計分之和的結果分為≤3分為弱陽性;≥4分為強陽性。

1.3 統計學分析應用SPSS 16.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，組間相關性采用Spearmann相關分析，對患者的生存分析應用Kaplan-Meier法統計并繪制生存曲線，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結直腸癌中表達情況AQP-5、MMP-2、MMP-9在結直腸癌原發(fā)灶中陽性表達率明顯高于正常結直腸癌黏膜(P ＜0.05);腫瘤組織TIMP-1、TIMP-2蛋白的陽性表達率明顯低于正常結直腸癌黏膜(P＜0.05)。見表1。

表1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結直腸癌組織、正常黏膜中的表達情況例(%)

2.2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結直腸癌組織表達情況與淋巴結轉移的關系收集62例淋巴結轉移陽性的患者資料，按UICC(2009年第7 版)淋巴結(N)分期的判斷，將淋巴結轉移分為N1組(淋巴結轉移＜4枚)和N2組(淋巴結轉移≥4枚)。 AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9蛋白陽性表達與淋巴結轉移程度有明顯關系，AQP-5、MMP-2、MMP-9蛋白在N2組表達比N1組增強，而TIMP-1、TIMP-2蛋白則在N1組表達強于N2組(P＜0.05)。見表2。

表2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達與結直腸癌淋巴結轉移數目關系例(%)

2.3 AQP-5表達情況與結直腸癌患者預后的關系根據結直腸癌組織中AQP-5的表達情況與預后的關系進行Kaplan-Meier分析并繪制生存函數曲線，發(fā)現AQP-5陽性表達患者的生存率低于陰性患者(χ2= 13.74，P＜0.01)。見圖1。

2.4 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白在結直腸癌腫瘤中表達的相關性在98例結直腸癌腫瘤中，AQP-5蛋白表達與MMP-2、MMP-9蛋白表達均呈正相關性(r=0.276，0.308;P=0.006，0.002)，AQP-5蛋白表達與TIMP-1、TIMP-2蛋白表達呈均負相關性(r=－0.328，－0.242;P＜0.001，0.016)。TIMP-1蛋白表達與MMP-2、MMP-9蛋白表達呈均負相關性(r=－0.366，－0.308;P＜0.01)，TIMP-2蛋白表達與MMP-2、MMP-9蛋白表達也呈均負相關性(r =－0.226，－0.204;P=0.025，0.044)，MMP-2蛋白表達與MMP-9蛋白表達呈正相關性(r=0.407，P＜0.01)。

圖1 結直腸癌患者AQP-5表達與預后關系的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

結直腸癌進展、轉移是多種基因造成的，分子機制復雜，確定轉移新基因有重要的意義。本研究對與結直腸癌淋巴結轉移有關的新基因水通道蛋白-5(aquaporin-5，AQP-5)的作用和臨床意義進行了研究。AQP-5基因在人類定位于染色體12q3，cDNA全長約1.8 kb，包含4個外顯子和3個內含子［7］。AQP-5與多種惡性腫瘤相關。研究發(fā)現AQP-5在宮頸癌中存在過表達，與臨床特征及預后有關［8］;還有研究表明AQP-5參與順鉑對卵巢癌細胞的增殖抑制，是卵巢癌的潛在治療靶基因［9］。另有研究發(fā)現AQP-5在結腸癌組織中高表達，且與結直腸癌的一些病理特征有關［4］。這些都說明AQP-5表達增高與腫瘤發(fā)生進展關系密切。本結果發(fā)現結直腸癌組織中AQP-5表達明顯比正常黏膜增強，說明AQP-5參與了結直腸癌的形成與進展;結果還發(fā)現淋巴結轉移較多的患者AQP-5表達更強，提示AQP-5可能對結直腸癌的淋巴結轉移有促進作用，檢測患者腫瘤中AQP-5表達可能對淋巴結轉移情況有較好的預測作用。Kaplan-Meier分析發(fā)現AQP-5陽性表達患者的生存率低于陰性患者，說明AQP-5過表達是結直腸癌預后不良的因素，提示患者預后較差。但本研究例數較少，還需要擴大研究規(guī)模對AQP-5的臨床意義予以確定。

為了解AQP-5促進結直腸癌淋巴結轉移的機制，本研究還檢測了與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達情況。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，有分解細胞周圍基質、促進腫瘤細胞遷移至其他部位的能力。而MMPs的抑制物TIMPs家族成員則具有抑制腫瘤細胞侵襲遷移的作用，其中主要成員為TIMP-1和TIMP-2。本研究發(fā)現，結腸癌組織中MMP-2、MMP-9表達高于癌旁正常黏膜，而TIMP-1、TIMP-2存在表達降低的現象。說明腫瘤組織中MMPs-TIMPs的動態(tài)平衡失調導致了腫瘤的發(fā)生和轉移。相關分析顯示在腫瘤組織中AQP-5與MMP-2、MMP-9存在正相關關系，而與TIMP-1、TIMP-2存在負相關，提示AQP-5可能通過調節(jié)下游基因及信號轉導通路等方式促進MMP-2、MMP-9表達，同時抑制TIMP-1、TIMP-2表達而發(fā)揮促進腫瘤侵襲轉移的作用，并導致結直腸癌淋巴結轉移。

總之，本研究發(fā)現AQP-5參與了結直腸癌的淋巴結轉移過程，其機制可能與AQP-5調控MMPs和TIMPs家族成員的表達及功能有關。AQP-5有可能成為抑制結直腸癌細胞生長及轉移的新靶點，并可能作為結直腸癌的腫瘤標志物及預后因子。但本研究規(guī)模較小，還有待進一步深入研究，通過擴大研究規(guī)模、開展分子生物功能實驗等方式闡明AQP-5與結直腸癌淋巴結轉移的關系。

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8 Zhang T，Zhao C，Chen D，et al.Overexpression of AQP5 in cervical cancer:correlation with clinicopathological features and prognosis.Med Oncol，2012，29:1998-2004.

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Effect and action mechanism of AQP-5 on lymphatic metastasis of colorectal cancer

LV Bonan，SHI Xiaoming，WU Shengchun，et al.Department of General Surgery，Hebei，Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin-5(AQP-5)in colorectal cancer，and to analyze the relationship between AQP-5 expression and lymphatic metastasis as well as prognosis of patients.At the same time，to detect the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 in colorectal cancer in order to explore their significance.M ethodsThe paraffin specimens of 98 cases of colorectal cancer tissues with positive lymph nodes metastasis and 40 cases of tumor adjacent tissues were collected.The expression levels of AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins were detected by immunohistochemistry(SP)，moreover the patients’clinical data were recorded and the patients were followed up to analyze the correlation between AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins Results The expression levels of AQP-5，MMP-2，MMP-9 in tumor tissues were significantly higher than those in tumor adjacent tissues，however，the expression levels of TIMP-1，TIMP-2 in tumor tissues were significantly lower than those in tumor adjacent tissues(P＜0.05).The expression levels of AQP-5，MMP-2 were positively correlated to the numbers of lymph node metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival time in patients with positive AQP-5 was relatively shorter(P＜0.05).The AQP-5 was closely related with MMP-2，MMP-9，TIMP-1in colorectal cancer tissues(P＜0.05).ConclusionAQP-5 can promote lymph node metastasis of colorectal cancer，and positive AQP is a sign of poor prognosis.AQP-5 may regulate the expression of proliferation-related proteins to realize the effect.

colorectal cancer;aquaporin-5;metastasis，lymph node;prognosis;proteins related to invasion and metastasis

R 735.34

A

1002－7386(2015)03－0346－03

2014－06－11)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.006

050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院普外二科