TCDD暴露對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠在位內(nèi)膜組織PR亞型和DNMT-1表達(dá)的影響

朱芳 崔照領(lǐng) 黃向華

TCDD暴露對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠在位內(nèi)膜組織PR亞型和DNMT-1表達(dá)的影響

朱芳 崔照領(lǐng) 黃向華

目的:探討TCDD暴露小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型在位內(nèi)膜DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT-1)、PR-A、PR-B的表達(dá)，以及PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度。方法60只C57BL/6雌性小鼠以2∶1與30只C3H雄性小鼠隨機(jī)合籠交配，根據(jù)母鼠妊娠第8天和雌性子鼠出生后21 d所暴露TCDD的劑量(μg/kg)分為5組，0/0組、0/3組、3/0組、3/3組及3/10組。每組均為12只雌性子鼠。以上組別除0/0組外，均于出生后49 d再次暴露TCDD (3 μg/kg)，出生后第70天給予TCDD(3 μg/kg)并實(shí)施自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)構(gòu)建小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，并且于術(shù)后3、6、9周各暴露1次TCDD(3 μg/kg)，術(shù)后12周取陰道脫落細(xì)胞將處于動情前期雌性子鼠脫臼處死。取其在位內(nèi)膜制成蠟塊，免疫組化SP法檢測在位內(nèi)膜DNMT-1、PR-A、PR-B的表達(dá)，以及甲基化特異PCR(MSP)檢測PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度。結(jié)果(1)DNMT-1在3/3組中的表達(dá)顯著高于0/0組(P＜0.01)，在3/10組中的表達(dá)顯著高于3/3組(P＜0.01);PR-B在0/0組中的表達(dá)顯著高于3/3組(P＜0.01)，在3/3組中的表達(dá)顯著高于3/10組(P＜0.01);4組PR-A的表達(dá)經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度3/3組中的表達(dá)高于0/0組(P＜0.05)，在3/10組中的表達(dá)高于3/3組(P＜0.05);4組PR-A基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論自胚胎期至成年期持續(xù)暴露TCDD有可能通過上調(diào)在位子宮內(nèi)膜DNMT-1的表達(dá)，從而使PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度增強(qiáng)，致使PR-B表達(dá)減弱，促進(jìn)了內(nèi)異癥的發(fā)生與發(fā)展。

子宮內(nèi)膜異位癥;TCDD;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1;PR-A;PR-B

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是指子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺體生長于子宮腔面以外的其他部位，其為一種雌激素依賴性良性疾病，但因其具有“轉(zhuǎn)移、侵襲”等惡性行為，被稱為“benign cancer”。其可導(dǎo)致女性痛經(jīng)、不孕等，且近年來發(fā)病率逐年上升，但到目前為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。隨著目前對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disturbing chemicals，EDCS)研究的逐步深入，二惡英類對人類健康的影響機(jī)制也在逐步深入。已有眾多研究表明二惡英促進(jìn)EMS的發(fā)生與發(fā)展［1，2］。我們先期通過二惡英類代表物TCDD暴露小鼠后自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)構(gòu)建內(nèi)異癥模型發(fā)現(xiàn)TCDD的確可以促進(jìn)腹膜及卵巢異位病灶的形成，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)了在位內(nèi)膜PR表達(dá)的下降，這種現(xiàn)象尤其表現(xiàn)在自胚胎期開始至成年期持續(xù)暴露TCDD的情況下。從而提示TCDD對子宮內(nèi)膜生物學(xué)性能的改變是一個(gè)從胚胎期至成年期的持續(xù)過程［3］。EMS發(fā)病機(jī)制中“在位內(nèi)膜決定論”得到了越來越多的研究證明，其認(rèn)為在位內(nèi)膜的特性是誘導(dǎo)EMS發(fā)病的關(guān)鍵因素［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)EMS患者在位內(nèi)膜孕酮受體B (PR-B)的缺失［5，6］，PR-B的缺失使17β羥膽固醇脫氫酶2型(17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase-2，17β-HSD-2)表達(dá)下降，導(dǎo)致病灶局部芳香化酶P450產(chǎn)生的雌激素活性不能被減弱，從而促進(jìn)EMS的發(fā)生［7］。這也成為EMS患者“孕酮抵抗”的一種解釋。而由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)介導(dǎo)的PRB基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化與其表達(dá)缺失有關(guān)［8］，已有研究表明TCDD具有表觀遺傳學(xué)的甲基化調(diào)節(jié)作用，且TCDD構(gòu)建的EMS模型中孕酮受體及其亞型分布發(fā)生了相似的改變。本研究通過建立小鼠EMS模型，觀察不同發(fā)育階段的小鼠暴露TCDD后，其在位內(nèi)膜DNMT-1、PR-A、PR-B的表達(dá)及PR-A、PRB基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度的情況，從表觀遺傳學(xué)的角度探討TCDD對EMS發(fā)病的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特殊病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6成熟小鼠60只，雌性，體重18～22 g;SPF級C3H成熟小鼠30只，雄性，體重20～24 g;均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑TCDD為標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99%，購自美國Cambridge Isotope Labe公司。DNMT-1一抗為兔抗DNMT-1單克隆抗體，購自北京博奧森生物科技有限公司，PR-A為hPRa7鼠單克隆抗體，PR-B為hPRa6鼠單克隆抗體，均購于美國Neomarker公司。二抗(山羊抗兔/小鼠IgG抗體-HRP多聚體)購自北京博奧森生物科技有限公司。甲基化特異PCR(Methylation specific PCR，MSP)引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，PCR反應(yīng)體系及DNA Marker購于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:60只C57BL/6雌性小鼠以2∶1與30只C3H雄性小鼠隨機(jī)合籠交配，以見陰道栓為受孕當(dāng)日，于受孕第8天將60只已孕母鼠隨機(jī)分為原對照組20只暴露TCDD(0 μg/kg)，和原暴露組40只暴露TCDD(3 μg/kg)，于生后21 d根據(jù)TCDD的暴露劑量［生前/生后(μg/kg)］原對照組所產(chǎn)子鼠隨機(jī)分為2個(gè)處理組:0/0、0/3組，原暴露組所產(chǎn)子鼠分為3個(gè)處理組分別為:3/0、3/3、3/10，每組12只。于出生后49 d除0/0組外每個(gè)處理組再次給予TCDD (3 μg/kg)，于出生后第70天給予TCDD(3 μg/kg)并實(shí)施自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)構(gòu)建小鼠EMS模型，并且于術(shù)后3、6、9周各暴露1次TCDD(3 μg/kg)，術(shù)后12周取陰道脫落細(xì)胞將處于動情前期雌性子鼠脫臼處死。

1.3.2 動物模型的建立:自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)。建模成功的標(biāo)準(zhǔn):肉眼觀:移植的子宮內(nèi)膜存活，移植物的體積增大，有血管形成，見內(nèi)含清亮液體的小囊泡;鏡下觀:病理檢查見囊內(nèi)有子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞，其間可見大量炎性細(xì)胞浸潤。

1.3.3 取材與檢測:建模后12周，取小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片見大量有核上皮細(xì)胞，少量角化上皮及少量粘液為動情前期，而后脫臼處死動物，取其子宮角中性甲醛固定，石蠟包埋。

1.3.4 免疫組化SP法檢測小鼠在位子宮內(nèi)膜DNMT-1、PR-A和PR-B的表達(dá):脫蠟、水化組織切片，微波爐間斷加熱抗原修復(fù)25～30個(gè)循環(huán)(切片放入盛檸檬酸緩沖液容器中加熱3 min，至剛沸騰，停10 s，加熱1 min，如此循環(huán))，3%過氧化氫甲醇溶液孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗5 min×3次。正常山羊血清封閉15～20 min，甩干，勿洗。加一抗(DNMT-1∶1∶100;hPra 6∶1∶50;hPra 7∶1∶50)37℃水浴箱孵育4 h，PBS溶液清洗5 min×3次，加二抗，室溫15 min，PBS溶液清洗5 min×3次，HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫10 min，PBS溶液清洗5 min ×3次，顯微鏡下加DAB溶液顯色約10 min。蘇木素復(fù)染1 min，水洗，乙醇脫干，封片。光鏡下觀察結(jié)果每張切片隨機(jī)連續(xù)選取不重疊的5個(gè)高倍視野(400 ×)，棕黃色為陽性表達(dá)區(qū)域。利用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)計(jì)算單位面積陽性染色區(qū)域平均光密度(optical density，OD)進(jìn)行比較以反映蛋白的相對含量。

1.3.5 MSP分析PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度:①石蠟組織中DNA的提取:切除多余的石蠟，暴露組織，將組織切碎(小于0.5 mm)，移入Ep管中，加入1 ml TES(10 mmol Tris-Hcl，1 mmol EDTA，0.5%SDS)溶液，充分振蕩，70℃水浴30 min，振蕩，4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清。重復(fù)3次。加入500 μl TET(100 mmol Tris-Hcl，1 mmol EDTA 1% TritonX-100)溶液和30 μl蛋白酶K，37℃水浴過夜。加入500 μl Tris-飽和酚，充分振蕩，4℃12 000 r/min離心10 min。取上層水相，加入等體積的Tris-飽和酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)，充分振蕩，4℃12 000 r/min離心10 min。取上層水相，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉(NaAc)，搖勻，37℃30 min。加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，搖勻，－20℃過夜。4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清，用70%乙醇洗2次，室溫干燥后，加入20 μl三羥甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸二鈉鹽(TE)緩沖液溶解DNA，－20℃保存。②DNA純度的測定:取5 μl DNA樣品，加雙蒸水至1 ml混勻后，用紫外分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm處讀取A值，A260/A280=1.8～2.0間方可使用。③DNA亞硫酸氫鈉(NaHSO3)修飾:取提取的DNA 20 μl加去離子水(dd·H2O)24.5 μl，加入3 mol/L NaOH 5.5 μl，37℃，15 min。加入3 mol/L NaHSO3(pH值5.0)280 μl+新鮮配置的10 mmol/L 1，4-苯二酚(C6H6O2)15 μl，55℃溫浴18 h(過夜)。透析方法:500 mmol/L NaAC，4℃，4 h;0.5 mmol/L C6H6O24℃，4 h;0.5 mmol/L NaAc，4℃過夜; dd·H2O 4℃，4 h，3次，最后1次4℃過夜。透析完畢，用NaAc和乙醇沉淀DNA，最后加入20 μl TE緩沖液溶解DNA，－20℃保存。④PCR擴(kuò)增引物［9］:由上海生工生物有限公司合成，具體序列及各自退火溫度見表1。⑤MSP反應(yīng)條件及反應(yīng)體系:PCR擴(kuò)增條件: 94℃變性3 min;(94℃40 s，各自退火溫度50 s，72℃60 s);35個(gè)循環(huán);72℃延伸12 min。反應(yīng)體系為25 μl，含10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μl;25 mmol/L MgCl2，1.5 μl;10 mmol/L dNTP 0.5 μl;10 μmol/L引物各1 μl;模板2 μl;5 U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl;上樣染料，穩(wěn)定劑，優(yōu)化劑等;余下用滅菌去離子水補(bǔ)足。震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCDD暴露小鼠在位子宮內(nèi)膜中DNMT-1、PR-A 及PR-B的表達(dá)5組雌性子鼠在位內(nèi)膜中DNMT-1的表達(dá):SP法顯示，DNMT-1主要在子宮內(nèi)膜腺體胞核中表達(dá)。0/0組、0/3組及3/0組DNMT-1的表達(dá)組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但其在3/3組中的表達(dá)顯著高于0/0組(P＜0.01)，在3/10組中的表達(dá)顯著高于3/3組(P＜0.01)。見表2，圖1。

表1 小鼠PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)甲基化與非甲基化引物

表2 5組小鼠在位子宮內(nèi)膜中DNMT-1、PR-A、PR-B的表達(dá)n=12，±s

表2 5組小鼠在位子宮內(nèi)膜中DNMT-1、PR-A、PR-B的表達(dá)n=12，±s

注:與0/0組比較，*P＜0.01;與3/3組比較，#P＜0.01

組別DNMT-1 PR-A PR-B 0/0組0.2143±0.0065 0.5383±0.0032 0.5251±0.0070 0/3組0.2102±0.0093 0.5401±0.0018 0.5294±0.0056 3/0組0.2104±0.0066 0.5390±0.0054 0.5288±0.0069 3/3組0.5207±0.0089*0.5402±0.0322 0.2362±0.0068*3/10組0.5749±0.0061*#0.5389±0.0014 0.1112±0.0077*#

2.2 5 組雌性子鼠在位內(nèi)膜中PR-B的表達(dá)SP法顯示，PR-B主要在子宮內(nèi)膜腺體胞核中表達(dá)。0/0組、0/3組及3/0組PR-B的表達(dá)組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但其在0/0組中的表達(dá)顯著高于3/3組(P＜0.01)，在3/3組中的表達(dá)顯著高于3/10組(P＜0.01)。見表2，圖2。

圖2 0/0組小鼠動情前期在位子宮內(nèi)膜中PR-B表達(dá)位于子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞胞核中，呈棕黃色(SP×400)

2.3 5 組雌性子鼠在位內(nèi)膜中PR-A的表達(dá)SP法顯示，PR-A主要在子宮內(nèi)膜間質(zhì)胞核中表達(dá)。5組PR-A的表達(dá)經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而同一組別中PR-A的表達(dá)要強(qiáng)于PR-B。見表2，圖3。

圖3 0/0組與3/10組小鼠動情前期在位子宮內(nèi)膜中PR-A主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞胞核中，呈棕黃色(SP×400)

2.4 5 組雌性子鼠在位內(nèi)膜中PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度0/0組與0/3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0/0組與3/0組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而0/0組與3/3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且3/3組高于0/0組(P＜0.05);3/3組與3/10組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且3/10組高于3/3(P＜0.05)。而各組中PR-A基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而同一組別中除0/0組外PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度要強(qiáng)于PR-A基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度。見表3，圖4、5。

圖4 0/0組12只小鼠動情前期在位子宮內(nèi)膜標(biāo)本中PR-B基因啟動子區(qū)CpG發(fā)生甲基化改變的為1只，而3/3組為7只。DNA marker自上向下依次為100、200、500、750、1 000、2 000 bp。目標(biāo)DNA長度為207 bp

圖5 0/0組12只小鼠動情前期在位子宮內(nèi)膜中PR-A基因啟動子區(qū)CpG島甲基化改變?yōu)?只，3/3組為3只。DNA marker同上。目標(biāo)DNA長度為125 bp

表3 5組小鼠在位子宮內(nèi)膜中PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度只

3 討論

3.1 TCDD暴露內(nèi)異癥模型在位內(nèi)膜PR及其亞型的表達(dá)已有眾多研究者就TCDD的免疫及內(nèi)分泌毒性對EMS發(fā)病機(jī)制的影響進(jìn)行深入研究，但Bruner-Tran等［10］就TCDD所引起的子宮內(nèi)膜“孕酮抵抗”導(dǎo)致EMS發(fā)生及發(fā)展機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，生長發(fā)育期暴露TCDD通過甲基化作用引起子宮內(nèi)膜PR表達(dá)的缺失，且持續(xù)數(shù)代。另有研究進(jìn)一步證明了TCDD對PR的下調(diào)作用中尤以對PR-B的下調(diào)明顯［11］。我們先期的研究也指出3/3組與3/10組中PR蛋白表達(dá)顯著低于其他各組，與間質(zhì)來源的旁分泌因子TGF-β2通過某種信號傳遞影響了在位內(nèi)膜MMP-3、MMP-7的表達(dá)，促進(jìn)逆流的子宮內(nèi)膜組織碎片黏附到腹膜、卵巢表面，并降解解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)，導(dǎo)致早期異位病灶的形成。本研究發(fā)現(xiàn)了在3/3組與3/ 10組中與其他各組相比PR-B的表達(dá)明顯下降。提示自胎兒期至成年期TCDD的持續(xù)暴露改變了子宮內(nèi)膜的生物學(xué)功能，PR-A/PR-B比例的失調(diào)有可能調(diào)節(jié)了MMPs的表達(dá)，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜的侵襲與粘附，并且PR-B的下降使17β-HSD-2表達(dá)下降，導(dǎo)致病灶局部芳香化酶P450產(chǎn)生的雌激素活性不能被減弱，這些都可能參與了EMS的形成與發(fā)展。

3.2 TCDD的甲基化修飾作用表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是研究生物表觀遺傳變異(epigenetic variation)現(xiàn)象的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。它是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了由上代傳于下代的可遺傳的改變，并且具有可復(fù)性［12］。DNA的甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要方面，一般是指甲基基團(tuán)與基因啟動子區(qū)中CpG島即二核苷酸島胞嘧啶環(huán)第5碳原子以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，利用S-腺苷蛋氨酸(SAM)作為甲基供體，形成了5-甲基胞嘧啶。甲基化過程則由DNMTs催化，在哺乳動物中主要包含三種具有活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1，DNMT3a和DNMT3b，DNMTs在小鼠胚胎早期發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)Dnmt1和Dnmt3敲除的小鼠胚胎(Dnmt1-/-和Dnmt3-/-)發(fā)育有缺陷，致死率高［13］，DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生一些半甲基化的CpG位點(diǎn)，Dnmt1可以特異性識別這些位點(diǎn)，并將這些半甲基化的CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化，即在新合成的DNA鏈上復(fù)制一個(gè)已經(jīng)存在的甲基化模式給新合成的DNA鏈。這個(gè)過程可以保證每個(gè)分裂產(chǎn)生的細(xì)胞都具有一定的DNA甲基化水平和甲基化狀態(tài)，因此具有維持甲基化狀態(tài)的功能［14］。目前發(fā)現(xiàn)在胚胎(胎兒)發(fā)育編程中，影響表觀遺傳修飾的主要因素有飲食和環(huán)境兩大方面，環(huán)境因素中就包括TCDD，植入前的小鼠胚胎若暴露于TCDD，印記基因IGF2和H19甲基化改變將使胎兒生長發(fā)育受到抑制，從而表明了TCDD表觀遺傳學(xué)的甲基化調(diào)節(jié)作用［15］。有學(xué)者在對胚胎期暴露EDCS對青春期、生育期及老齡期卵巢功能的影響研究中也發(fā)現(xiàn)了基因組的廣泛甲基化變化，而這些有可能與Rapid Estrogen Signaling，PI3K/Akt signaling pathway，PTEN Signaling，IGF-1 Signaling有關(guān)［16］。在EDCS的研究中發(fā)現(xiàn)，其對胚胎生殖系統(tǒng)的發(fā)育毒性可能與乳糖轉(zhuǎn)鐵蛋白(1actotransferrin)基因的持續(xù)表達(dá)有關(guān)，乳糖轉(zhuǎn)鐵蛋白持續(xù)表達(dá)能夠參與調(diào)節(jié)基因元件去甲基化抑或甲基化狀態(tài)［17］。該研究還指出EDCS的雌激素作用增強(qiáng)了雌激素與受體的結(jié)合，增加了靶細(xì)胞或組織中c-fos及c-jun基因的表達(dá)，而c-fos的過度表達(dá)可上調(diào)與DNA甲基化相關(guān)的胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。隨著環(huán)境基因組學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展，有關(guān)其作用機(jī)制方面的具體研究正逐步深入。本研究表明小鼠EMS模型中0/0、0/ 3、3/0組中由DNMT-1所介導(dǎo)的甲基化作用并沒有明顯改變成年小鼠子宮內(nèi)膜的生物學(xué)特性，而自胚胎期開始至成年期持續(xù)暴露TCDD卻增強(qiáng)了此作用，改變了子宮內(nèi)膜的生物學(xué)功能，TCDD的這種甲基化調(diào)節(jié)作用有可能促進(jìn)了EMS的形成與發(fā)展。

3.3 EMS模型中TCDD與DNMT-1、PR-A、PR-B表達(dá)及PR-A、PR-B基因啟動子區(qū)CpG甲基化程度的關(guān)系

EMS患者在位內(nèi)膜PR-B的缺失促進(jìn)了該病的發(fā)生與發(fā)展，而EMS患者中也發(fā)現(xiàn)了PR-B基因啟動子區(qū)的超甲基化改變［18］。PR-B基因啟動子區(qū)的超甲基化與其表達(dá)缺失有關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，盡管DNMT-1在維持小鼠正常生理功能方面起著至關(guān)重要的作用，但自胚胎期至成年期持續(xù)的TCDD暴露增強(qiáng)了在位子宮內(nèi)膜DNMT-1的作用，使PR-B基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生了超甲基化改變，從而使其表達(dá)下降，并且與生長發(fā)育早期所接受的劑量有一定的相關(guān)性。而對PR-A這種調(diào)節(jié)作用卻不顯著。TCDD有可能通過DNMT-1所介導(dǎo)的甲基化作用最終使PR-B表達(dá)發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致局部子宮內(nèi)膜的生物學(xué)功能以及其對激素的反應(yīng)發(fā)生了改變，促進(jìn)了EMS的發(fā)生與發(fā)展。而又由于PR-A、PR-B在組織的表達(dá)具有組織及階段特異性［19］，并且兩種受體亞型間以及其與ER亞型間復(fù)雜的干擾機(jī)制是否影響了TCDD對PR-B的這種調(diào)節(jié)作用尚有待于進(jìn)一步深化研究。

1 Eskenazi B，Ocarelli P，Warner M，et al.Serum dioxin concentrations and endometriosis:a cohort study in Seveso，Italy.Environ Health Perspect，2002，110:629-634.

2 崔照領(lǐng)，黃向華.二惡英與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病關(guān)系研究進(jìn)展.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2010，26:886-888.

3 崔照領(lǐng)，黃向華，王振海.TCDD暴露對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠在位內(nèi)膜組織中TGF-β2、PR、MMP-3和MMP-7表達(dá)的影響.中華婦產(chǎn)科雜志，2011，46:946-948.

4 郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥研究的新里程.中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40: 3-4.

5 Attia GR，Zeitoun K，Edwards D，et al.Progesterone receptor isoform A But Not B is expressed in endometriosis.Clin Endocrinol Metab，2000，85:2897-2902.

6 呂艷文，張淑蘭，王丹波.孕激素受體與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系.中國全科醫(yī)學(xué)，2008，15:1342-1344.

7 Bulun SE，Cheng YH，Pavone ME，et al.17b-HydroxysteroidDehydrogenase-2 Deficiency and Progesterone Resistancein Endometriosis.Semin Reprod Med，2010，28:44-50.

8 Sasaki M，Dharia A，Oh BR，et al.Progesterone receptor B gene inactivation and CpG hypermethylation in human uterine endometrial cancer.Cancer Res，2001，61:97-102.

9 Wargon V，F(xiàn)ernandez SV，Goin M，et al.Hypermethylation of the progesterone receptor A in constitutive antiprogestin-resistant mouse mammary carcinomas.Breast Cancer Res Treat，2011，126:319-332.

10 Bruner-Tran KL，Ding TB，Osteen KG.Dioxin and Endometrial Progesterone Resistance.Semin Reprod Med，2010，28:59-68.

11 Igarashi TM，Bruner-Tran KL，Yeaman GR，et al.Reduced expression of progesterone receptor-B in the endometrium of women with endometriosis and in cocultures of endometrial cells exposed to 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.Fertil Steril，2005，84:67-74.

12 Issa JP.Epigenetic variation and human disease.J Nutr，2002，132(8 Suppl):2388-2392.

13 Okano M，Bell DW，Haber DA，et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.Cell，1999，99:247-257.

14 楊曉丹，韓威，劉峰.DNA甲基化與脊椎動物胚胎發(fā)育.遺傳，2012，34:1108-1113.

15 黃偲璇，徐丹，汪暉.胚胎(胎兒)發(fā)育編程中的表觀遺傳修飾現(xiàn)象.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2008，28:291-296.

16 Zama AM，Uzumcu M.Targeted genome-wide methylation and gene expression analyses reveal signaling pathways involved in ovarian dysfunction after developmental EDC exposure in rats.Biol Reprod，2013，88: 52.

17 McLachlan JA.Environmental signaling:what embryos and evolution teach us about endocrine disrupting chemicals.Endocr Rev，2001，22: 319-341.

18 Yan Wu，Strawn E，Basir Z，et al.Promoter hypermethylation of progesterone receptor isoform B(PR-B)in Endometriosis.Epigenetics，2006，1:106-111.

19 Mylonas I，Jeschke U，Shabani N，et al.Steroid receptors ERalpha，ER-beta，PR-A and PR-B are differentially expressed in normal and atrophic human endometrium.Histol Histopathol，2007，22:169-176.

Effect of TCDD exposure on the expression of PR isoforms and DNMT-1 of eutopic endometrium in m ice

ZHU Fang*，CUI Zhaoling，HUANG Xianghua，et al.*Department of Obstetrics and Gynecology，The First Hospital of Hebei，Handan 056500，China

Objectives To investigate the influence of TCDD on the expression of PR isoforms(PR-A and PR-B)and DNA methyltransferase-1(DNMT-1)of eutopic endometrium in mice，and to explore the methylation of CpG islands in the promoter region of PR-A and PR-B gene.M ethodsSixty mice divided into 0/0，0/3，3/0，3/3，3/10 groups，with 12 female mice in each group.The mice in each group

TCDD(3μg/kg)again on the 49th day after birth except for the 0/0 group.On the 70th day after birth autotransplantation of endometrium was performed to establish the endometriosis models，at the same time，the mice in each group were exposed to TCDD(3μg/kg)again except for 0/0 group.After the surgery the mice in exposure groups received TCDD(3μg/kg)respectively at 3，6，9 weeks.Finally，at 12 weeks after surgery the mice were executed，the the endomembrane in the position was entrapped with paraffin blocks，and the expression levels of DNMT-1，PR-A were detected by immunohistochemistry(SP)，moreover，the methylation of CpG islands in promoter region of PR-A and PR-B gene was detected by methylation-specific PCR(MSP).ResultsThe expression levels of DNMT-1 in 3/3 group were significantly higher than those in 0/0 group(P＜0.01)，at the same time，which in 3/10 group were significantly higher than those in 3/3 group(P＜0.01).However the expression levels of PR-B in 0/0 group were significantly higher than those in 3/3 group(P＜0.01)，which in 3/3 group were significantly higher than those in 3/10 group(P＜0.01).But there were no significant differences in the expression levels of PR-A among different groups(P＞0.05).(2)The methylation degree of CpGs islands of PR-B gene in 3/3 group was significantly higher than that in 0/0 group(P＜0.05)，which in 3/10 group was significant higher than that in 3/3 group(P＜0.05).However there was no significant difference in methylation degree of PR-A among different groups(P＞0.05).ConclusionTCDD may enhance methylation degree of CpG islands in promoter of PR-B gene by up-regulating the expression of DNMT-1 to reduce the expression of PR-B of eutopic endometrium in mice，as a result，which may promote the pathogenesis and development of endometriosis.

endometriosis;TCDD;DNA methyltransferase-1;PR-A;PR-B

R 711.71

A

1002－7386(2015)03－0334－05

2014－03－20)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.003

056500河北省邯鄲市第一醫(yī)院(朱芳);河北省石家莊市婦幼保健院(崔照領(lǐng));河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(黃向華)

黃向華，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院; E-mail:huangxh2003@163.com