Rh部分D基因型分析

何路軍 喬芳 石翠英 王振雷 趙志弘 劉敬閃 張虹 田亞娟

·論著·

Rh部分D基因型分析

何路軍 喬芳 石翠英 王振雷 趙志弘 劉敬閃 張虹 田亞娟

目的研究7例Rh部分D樣本的基因分型。方法采用PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)為D變異型的樣本中的Rh部分D進(jìn)行D基因分型。結(jié)果在30例常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)中，23例具有完整的RHD基因外顯子(Rh弱D型)，7例部分外顯子缺失，為Rh部分D，23例為弱D型，并對(duì)部分D樣本進(jìn)行了基因分型，4例檢測(cè)為D Cat.ⅥⅢ，1例為D Cat.Ⅵtype2，1例為D Cat.Ⅵtype 1，1例為基因2.9外顯子融合，表示為RHD-CE(2-9)-D。結(jié)論Rh部分D型與弱D型在血清學(xué)試驗(yàn)中無(wú)法區(qū)分，采用分子生物學(xué)方法才能夠更準(zhǔn)確的分型，更能確保輸血安全。

Rh陰性;Rh部分D;弱D;基因型

Rh血型在臨床輸血中具有重要意義，也是人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜、最具多態(tài)性的系統(tǒng)。Rh抗原是由位于人類染色體lp34.3～36.1區(qū)域上的2個(gè)同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RHD和RhCE基因，每個(gè)基因都是由10個(gè)外顯子組成;RH基因編碼的抗原多肽，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，貫穿紅細(xì)胞膜12次，有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞外形成6個(gè)環(huán)，Rh的抗原決定簇就位于這6個(gè)環(huán)上［1］。D抗原抗體與輸血的關(guān)系僅次于ABO血型，50%～75%Rh(D)陰性人接受Rh(D)陽(yáng)性的血可能產(chǎn)生抗-D，導(dǎo)致免疫性輸血反應(yīng)［2］。為了減少輸血反應(yīng)，正確檢定Rh(D)陰性個(gè)體顯得非常重要。D抗原存在多種變異體，如部分D、弱D、D放散型等。D抗原的分布與表達(dá)強(qiáng)弱不一，RhD常規(guī)定型技術(shù)無(wú)法鑒定，而分子生物學(xué)方法對(duì)于探討其分子背景更為有利。

1 材料與方法

1.1 材料30例受檢樣本均來(lái)源于河北省血液中心的非親緣無(wú)償獻(xiàn)血者，經(jīng)常規(guī)血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)為RhD變異型。

1.2 方法

1.2.1 試劑:Rh定型常規(guī)血清學(xué)檢查參照《中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程》［3］。3批抗-D血清來(lái)源:上海血液生物醫(yī)藥有限公司、德國(guó)BIOTEST公司、美國(guó)IMMUCOR公司。將初篩RhD陰性者的紅細(xì)胞與單克隆抗D (IgM+IgG)及不完全抗D血清(IgG)做AHG，設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照?？笵血清100 μl及2%～5%被檢紅細(xì)胞50 μl加入試管中，37℃孵育30 min，三洗后分別加入IgG 100 μl，混勻后3 000 r/min，離心15 s，觀察結(jié)果。與任意抗D全部凝集或部分凝集者判定為D變異型，并重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.2 DNA提取:嚴(yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA純化試劑盒說(shuō)明書操作，提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280以確定DNA濃度及純度。置于-20℃保存。

1.2.3 序列特異性引物PCR(sequence specific p～imers，SSP)根據(jù)RHD基因PCR引物體系(由上海生工公司合成)，以HGH(human growth hormone，HGH)為內(nèi)對(duì)照，對(duì)RHD基因第3、4、5、6、7、9特異性外顯子進(jìn)行等位基因特異性PCR擴(kuò)增。

1.2.4 基因檢測(cè):采用天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司研制的《人類紅細(xì)胞RHD血型部分D基因檢測(cè)試劑盒》對(duì)該7例樣本進(jìn)行分析。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 30例經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)為RhD變異型的樣本中，23例具有完整的RHD基因外顯子即為Rh弱D型，7例部分外顯子缺失，為Rh部分D。見圖1。

2.2 7例部分D中，4例樣本檢測(cè)為D Cat.VI III，1例樣本檢測(cè)為D Cat.VI type2，1例樣本檢測(cè)為D Cat. VI type1，1例檢測(cè)為RHD基因2～9外顯子融合，表示為RHD-CE(2-9)-D。見圖2。

圖1 RHD特異性外顯子檢測(cè)電泳圖(弱D與部分D)

圖2 部分D基因檢測(cè)電泳圖

3 討論

在紅細(xì)胞30個(gè)血型系統(tǒng)中，Rh血型系統(tǒng)是最具復(fù)雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng)，近年來(lái)，隨著編碼Rh蛋白的基因被克隆、測(cè)序和越來(lái)越多的深入研究，Rh抗原的一些分子機(jī)制也逐步被發(fā)現(xiàn)。RhD抗原分為D陽(yáng)性、D陰性和D變異型，而Rh(D)變異型包括鹽水法陰性、只能通過(guò)IAT試驗(yàn)檢測(cè)到D抗原的弱D變異型和部分D變異型，以及只有吸收放散試驗(yàn)陽(yáng)性的DEL變異型;弱D抗原的改變位于細(xì)胞膜內(nèi)和膜中，細(xì)胞膜外的蛋白質(zhì)沒(méi)有改變，只有抗原數(shù)量的改變而抗原性質(zhì)未改變;部分D抗原的改變則位于細(xì)胞膜外，抗原性和數(shù)量都發(fā)生了改變［4］。部分D和弱D具有不同的分子遺傳機(jī)制，形成弱D的氨基酸替換主要位于胞漿內(nèi)和跨膜區(qū)域，表現(xiàn)為抗原位點(diǎn)數(shù)目減少，但抗原表位數(shù)目基本不變;而部分D的分子形成機(jī)制有3類，分別是RHD/CE融合等位基因(hybrid allels)、細(xì)胞外環(huán)的錯(cuò)義突變和散在的錯(cuò)義突變［4］。形成部分D(partial D)的氨基酸變異主要位于胞外區(qū)域，表現(xiàn)為缺失一個(gè)或多個(gè)抗原表位，因此部分D更易產(chǎn)生抗體。多數(shù)部分D是由于RHD基因一部分被相應(yīng)RHCE基因部分替換形成的RHD/CE融合等位基因，這種D變異體稱為D類別(D category)。目前國(guó)際上經(jīng)RHD全基因序列分析鑒定和Genebank登錄的部分D已發(fā)現(xiàn)6個(gè)類別，用DI～DVI表示。我們?cè)谥暗难芯恐幸寻l(fā)現(xiàn)兩種D類別，即DBT-1和RHD-CE(4-9)-D［5］，在后續(xù)的部分D樣本基因型的檢測(cè)中，我們又發(fā)現(xiàn)了D Cat.VIⅢ、D Cat.VI type1、D Cat.VI type2和RHD-CE(2-9)-D四種基因型。隨著研究樣本數(shù)量的增加，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的部分D的基因型及分子背景，對(duì)于安全輸血和遺傳學(xué)的研究都具有重要的價(jià)值。

部分D的氨基酸改變主要位于胞外環(huán)，引起紅細(xì)胞膜上Rh(D)抗原缺乏某些表位，血清學(xué)特征為表達(dá)不完整的D抗原，若受到D陽(yáng)性細(xì)胞(或攜帶部分D所缺失的表位D細(xì)胞)刺激，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)缺失表位的抗體。若部分D作為供血者輸給Rh(D)陰性受血者，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)其攜帶表位的抗體，引起溶血反應(yīng)。弱D表型的患者輸入Rh(D)陽(yáng)性紅細(xì)胞時(shí)一般不會(huì)產(chǎn)生抗-D［6］。國(guó)內(nèi)有報(bào)道部分DVI type3型個(gè)體產(chǎn)生抗體［7］。而弱D和部分D血清學(xué)手段無(wú)法區(qū)分和鑒定，只有通過(guò)分子生物學(xué)檢測(cè)予以鑒別。因此，準(zhǔn)確鑒定部分D和弱D對(duì)于指導(dǎo)臨床輸血和節(jié)約Rh陰性血庫(kù)存，更有效的利用稀有血型資源具有重要的意義。

1Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system:a review.Blood，2000，95:375-387.

2林甲進(jìn)，朱碎永，白植地.Rh弱D，Del的檢測(cè)及意義.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，38:361-362.

3李勇，楊貴貞主編.人類紅細(xì)胞血型學(xué)實(shí)用理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù).第1版.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1999.70.

4Flegel WA，Wagner FF.Molecular biology of partial D and weak D:implications for blood bank practice.Clin Lab，2002，48:53-59.

5喬芳，石翠英，何路軍，等.4例Rh部分D基因型研究.河北醫(yī)藥，2011，33:769-770.

6Wagner FF，F(xiàn)rohmajer GF，Ladewig B，et al.Weak D alleles express distinct phenotypes.Blood，2000，95:2699-2708.

7左宏莉，何智，羅廣平，等.RhD VI III表型分子生物學(xué)研究及其臨床意義.中國(guó)輸血雜志，2008，21:174-176.

Analysis for partial RhD genotype

HE Lujun，QIAO Fang，SHI Cuiying，et al．Hebei Provincial Blood Center，Shijiazhuang

050071，China

ObjectiveTo investigate genotyping of 7 cases of partial RhD specimens.MethodsThe genetyping technique(PCR-SSP)was performed for partial RhD variants identified by common serological tests.ResultsAmong 30 specimens identified as D variants during routine serological experiment，7 specimens were defined as partial RhD and 23 specimens as weak D.Then 7 specimens of partial RhD were genetyped further in which 4 cases were D Cat.ⅥⅢ，1 case was D Cat.Ⅵtype 2，1cases was D Cat.Ⅵtype 1 and 1 case was RHD-CE(2-9)-D.ConclusionThe routine serological experiments can not differentiate partial D from weak D，however，the molecular biological methods can type accurately in order to ensure the safety of blood transfusion.

Rh negative;partial RhD;weak D;genotype

R 349.6

A

1002-7386(2015)02-0179-03

2013-12-06)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．005

項(xiàng)目來(lái)源:河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):09276102D-40)

050071石家莊市，河北省血液中心