通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織LN和FN表達(dá)的影響

劉敏 王超 邢邯英 王杏

·論著·

通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織LN和FN表達(dá)的影響

劉敏 王超 邢邯英 王杏

目的探討通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織纖維粘連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)表達(dá)的影響。方法40只KK/Upj-Ay小鼠分為模型組與通心絡(luò)高、中、低劑量(4、2、1 g/kg)組，每組10只，灌胃途徑給藥，持續(xù)12周;另取10只C57BL/6小鼠作正常對照組。應(yīng)用RT-PCR法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜組織中FN、LN的mRNA表達(dá); Western blot法檢測視網(wǎng)膜組織中FN、LN蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織LN、FN mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，通心絡(luò)低、中、高各劑量組LN、FN mRNA和蛋白表達(dá)水平均較模型組明顯下降(P＜0.05)。結(jié)論通心絡(luò)膠囊可通過抑制糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織LN、FN的表達(dá)從而改善視網(wǎng)膜病變。

通心絡(luò)膠囊;糖尿病視網(wǎng)膜病變;纖維粘連蛋白;層粘連蛋白

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)目前是主要的致盲原因之一［1］，也是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。糖尿病視網(wǎng)膜病變基本的病理改變?yōu)槊?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、基底膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、通透性增加、新生血管形成和纖維組織化［2］?；啄榧?xì)胞外基質(zhì)的存在方式之一，層粘連蛋白(LN)和纖維粘連蛋白(FN)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附、增殖、遷移及分化等過程［3］。本實驗應(yīng)用KK/Upj-Ay自發(fā)性2型糖尿病小鼠模型，觀察通心絡(luò)膠囊對糖尿病視網(wǎng)膜組織LN、FN表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF清潔級KK/Upj-Ay糖尿病小鼠40只，體重30～40 g;SPF清潔級C57BL/6小鼠，體重25～30 g，均為雄性，12周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號:SCXK-(京)2009-0002。

1.2 藥品與試劑通心絡(luò)膠囊購于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，層粘連蛋白(FN)、纖維粘連蛋白(LN)抗體均購于abcam公司。

1.3 實驗分組與給藥KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值(FBG)隨機(jī)分為模型組、通心絡(luò)高劑量組、通心絡(luò)中劑量組、通心絡(luò)低劑量組，對照組使用C57BL/6小鼠，每組均為10只。通心絡(luò)高、中、低劑量組分別給予生藥量4、2、1 g/kg的通心絡(luò)膠囊，對照組和模型組分別給予等體積的蒸餾水，每組均采用灌胃途徑給藥，1次/d，連續(xù)給藥3個月。

1.4 Real Time PCR(qPCR)方法測定FN、LN mRNA的表達(dá)取小鼠眼球，仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織，常規(guī)方法提取RNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。GAPDH引物:上游5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3＇，下游5＇-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3＇，產(chǎn)物片段143 bp;FN引物:上游5＇-GGAGAACCAGGAGAGCACAC-3＇，下游5＇-CACAAACTGTAGGTCCGTCG-3＇，產(chǎn)物片段97 bp;LN引物:上游5＇-AAGGGCTTTGGGATGTCAT-3＇，下游5＇-CGAGTCCAGTTCAGCGTGA-3＇，產(chǎn)物片段88 bp;實驗結(jié)果與對照組進(jìn)行比較后的相對值記為最終結(jié)果，對照組設(shè)置為1。

1.5 Western blot法檢測FN、LN蛋白的表達(dá)取視網(wǎng)膜組織，低溫儲存，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用S-N-K法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜FN、LN mRNA表達(dá)變化與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織LN mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05);通心絡(luò)低、中、高各劑量組LN mRNA表達(dá)水平均較模型組明顯下降(P＜0.05)，隨著劑量的增加LN的表達(dá)逐漸下降，各組之間互相比較差異均具有顯著性(P＜0.05)。與對照組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織FN mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);而低、中、高劑量組FN mRNA表達(dá)水平均較模型組明顯降低(P＜0.05)，而高劑量組較中、低劑量組的表達(dá)下調(diào)更為明顯(P＜0.05)。見表1。

表1 5組視網(wǎng)膜LN、FN mRNA表達(dá)比較n=10，±s

表1 5組視網(wǎng)膜LN、FN mRNA表達(dá)比較n=10，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與通心絡(luò)高劑量組比較，△P＜0.05

組別LNFN對照組1.12±0.151.02±0.09模型組5.21±0.53*4.02±0.48*#通心絡(luò)低劑量組4.13±0.29*#3.49±0.39*#△通心絡(luò)中劑量組3.07±0.33*#3.17±0.30*#△通心絡(luò)高劑量組2.63±0.22*#2.39±0.26*#F值110.32262.199 P值0.0000.000

2.2 視網(wǎng)膜FN、LN蛋白的表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示模型組小鼠視網(wǎng)膜FN、LN蛋白表達(dá)均明顯高于對照組(P＜0.05);與模型組比較，通心絡(luò)各劑量組FN、LN蛋白表達(dá)均顯著下降(P＜0.05)。見表2，圖1。

3 討論

DR是一種世界性的致盲眼病，是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，高血糖是DR視網(wǎng)膜損傷的重要始發(fā)因素［4］。持續(xù)性的高血糖狀態(tài)可以誘發(fā)包括蛋白激酶C激活、氧化應(yīng)激、氨基己糖通路活性增高等一系列代謝異常，誘發(fā)一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)造成視網(wǎng)膜循環(huán)障礙［5］，使周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞失去調(diào)節(jié)能力，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜增厚，進(jìn)而造成毛細(xì)血管的阻塞引起周圍組織缺血水腫，伴微血栓形成甚至血管閉塞［6］。視網(wǎng)膜微血管閉塞性改變，屬中醫(yī)“絡(luò)病”范疇，臨床用藥清除瘀血，通其血脈，偏重治絡(luò)，藥物選擇應(yīng)在整體辨證的基礎(chǔ)上，加上辛味藥和蟲類藥的應(yīng)用，以達(dá)到扶正及祛邪通絡(luò)的目的［7］。通心絡(luò)是一種由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻、赤芍等組成的中藥復(fù)方制劑;有研究表明，其可改善糖尿病患者視網(wǎng)膜微循環(huán)，減輕視網(wǎng)膜及黃斑水腫，療效確切［8］。

表2 5組視網(wǎng)膜LN、FN蛋白表達(dá)比較n=10，±s

表2 5組視網(wǎng)膜LN、FN蛋白表達(dá)比較n=10，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與通心絡(luò)高劑量組比較，△P＜0.05

組別LNFN對照組0.16±0.030.19±0.04模型組0.74±0.06*0.72±0.06*通心絡(luò)低劑量組0.35±0.05*#0.39±0.06*#△通心絡(luò)中劑量組0.32±0.04*#0.37±0.05*#△通心絡(luò)高劑量組0.23±0.03*#0.28±0.03*#F值137.06684.350 P值0.0000.000

圖1 5組Western blot結(jié)果

隨著對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的分子結(jié)構(gòu)和功能的研究，發(fā)現(xiàn)ECM在DR發(fā)生中具有重要的作用，已引起中外學(xué)者的關(guān)注［9］。FN、LN是ECM大家族中的重要成員，是構(gòu)成基底膜的主要成分，F(xiàn)N可以與細(xì)胞外基質(zhì)各類成分相結(jié)合，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)其他成分的沉積;LN則可以引起細(xì)胞黏附并影響基底膜的電荷選擇性，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性改變，加重視網(wǎng)膜損傷［10］。因此，F(xiàn)N、LN作為細(xì)胞與間質(zhì)相互作用的橋梁，在DR的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

本實驗觀察通絡(luò)藥物通心絡(luò)膠囊對自發(fā)性2型糖尿病小鼠(KK/Upj-Ay小鼠)視網(wǎng)膜病變的影響。結(jié)果顯示模型組小鼠視網(wǎng)膜組織FN、LN的表達(dá)與對照組比較顯著升高(P＜0.05)，給予通心絡(luò)灌胃治療后，通心絡(luò)高、中、低劑量組小鼠視網(wǎng)膜組織FN、LN的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，提示通心絡(luò)膠囊可通過抑制糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織FN、LN的合成，緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變，為中醫(yī)治療DR提供了理論依據(jù)。

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3潘琳，李光偉，周水平，等.細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和層粘連蛋白在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病變表達(dá)的研究.中華糖尿病雜志，2004，12:56-59.

4Choudhuri S，Dutta D，Sen A，et al.Role of N-?-carboxy methyl lysine，advanced glycation end products and reactive oxygen species for the development of nonproliferative and proliferative retinopathy in type 2 diabetes mellitus.Mol Vis，2013，19:100-113.

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6趙凌軍.中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床效果分析.中國實用醫(yī)藥，2014，9:165-166.

7郭承偉，張宏國，馬棟.從絡(luò)論治糖尿病視網(wǎng)膜病變的理論與應(yīng)用探討.中國中醫(yī)眼科雜志，2011，21:255-257.

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10苑維，金明，潘琳，等.紅參對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病變細(xì)胞外基質(zhì)的影響.中國中醫(yī)眼科雜志，2004，14:200-203.

Effects of Tongxinluo capsule on the expression of FN and LN in retina of diabetic mice

LIU Min，WANG Chao，XING

Hanying，et al．Hebei Provincial Geriatric Key Laboratory，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo explore the effect of Tongxinluo capsule on the expression of fibronectin(FN)and laminin (LN)in retina of KK/Upj-Ay mice.MethodsForty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into 4 groups:model group，Tongxinluo low-dose group(1g/kg)，median-dose group(2g/kg)，high-dose(4g/kg)group.The mice were given medicines intragastrically once a day for consecutive 12 weeks.The other 10 C57BL/6 mice were enrolled as control group.The expression levels of FN and LN mRNA in retina were detected by Real time PCR，and the contents of protein were determined by Western blotting.ResultsAs compared with those in control group，the expression levels of LN，F(xiàn)N mRNA and protein in retina in model group were significantly increased(P＜0.05)，however，which in Tongxinluo low-dose group，median-dose group，high-dose group were significantly decreased，as compared with those in model group(P＜0.05).Conclusion

Tongxinluo capsule may improve diabetic retinopathy by inhibiting the expression of LN and FN in retina tissue of diabetic mice.

Tongxinluo capsule;diabetic retinopathy;fibronectin;laminin

R 587.2

A

1002-7386(2015)02-0174-03

2014-09-22)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．003

項目來源:國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號: 2012GB518606)

050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點實驗室