IL-1β、IL-4在濕熱證潰瘍性結腸炎大鼠模型中的動態(tài)表達及意義

張 歆，柯 曉，陳錦團，高尤亮，周 凡

（1.福建中醫(yī)藥大學臨床技能教學中心，福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003；3.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州 350003）

◇中醫(yī)藥研究◇

IL-1β、IL-4在濕熱證潰瘍性結腸炎大鼠模型中的動態(tài)表達及意義

張 歆1，柯 曉2，陳錦團1，高尤亮2，周 凡3

（1.福建中醫(yī)藥大學臨床技能教學中心，福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003；3.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州 350003）

目的 檢測IL-1β和IL-4在濕熱證潰瘍性結腸炎（UC）大鼠血清中的表達，探索其在評價炎癥嚴重程度中的作用及意義。方法 將50只健康SPE級Wistar大鼠（雌雄各半），隨機分成5組：正常組及濕熱證UC模型Ⅰ（3 d）組、Ⅱ（7 d）組、Ⅲ（14 d）組、Ⅳ（21 d）組，每組均10只大鼠。除正常組在自然環(huán)境飼養(yǎng)外，其余各濕熱證UC模型組均置于高脂高糖飲食及高溫高濕環(huán)境中，喂養(yǎng)4周后，用TNBS-乙醇灌腸法誘發(fā)濕熱證UC。檢測各組大鼠疾病活動指數（DAI）、結腸黏膜損傷指數（CMDI）、IL-1β及IL-4含量的變化。結果 與正常組比較，濕熱證UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠DAI、CMDI、IL-1β含量顯著升高（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ組升高最為明顯（P＜0.01）；血清IL-4含量明顯下降（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ組下降最為明顯（P＜0.01）；模型Ⅳ組上述指標均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論 在濕熱型UC發(fā)病過程中炎性細胞因子IL-1β、IL-4參與了其發(fā)病過程，且IL-1β上升及IL-4下降水平同炎癥嚴重程度在時間上是一致的，可作為炎癥嚴重程度的評價指標。

濕熱；潰瘍性結腸炎；疾病活動指數（DAI）；結腸黏膜損傷指數（CMDI）；IL-1β；IL-4

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因及發(fā)病機制尚不明確的直腸和結腸慢性、反復發(fā)作性、非特異性腸道炎癥疾?。?］。中醫(yī)將其歸入泄瀉、痢疾等范疇，治療上多采用辨證施治的原則，根據相應的證型選用不同的方藥。研究表明，大腸濕熱證是UC的臨床中醫(yī)證型中以最為常見的一種［2］。腸道黏膜免疫系統(tǒng)中促炎細胞因子與抗炎細胞因子的失衡被認為是UC的重要發(fā)病機制，二者的平衡對于炎性反應程度與臨床預后有重要的意義［3］。因此，本實驗應用高脂高糖飲食及高溫高濕環(huán)境結合TNBS-乙醇灌腸法誘發(fā)濕熱型UC，通過檢測大鼠疾病活動指數、組織大體形態(tài)學評分、IL-1β及IL-4的變化，為臨床應用提供新的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPE級Wistar大鼠50只，雌雄各半，體質量200～240 g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，購于上海市斯克萊實驗動物有限責任公司［許可證號碼：SCXK（滬）2007-0005號］。

1.2 藥品與試劑三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma公司提供；便隱血（OB）試劑盒，珠海貝索生物技術有限公司提供；IL-1β、IL-4檢測試劑盒購于上海BV公司。

1.3 主要儀器設備酶標儀（MK3型）（芬蘭雷勃公司）；人工氣候箱（LRH-800-G型）（廣東省韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 動物分組及模型復制將50只健康SPE級Wistar大鼠（雌雄各半）隨機分成5組：正常組、濕熱證UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，每組均10只大鼠。除正常組在自然環(huán)境［室內溫度（26±2）℃，相對濕度45%～60%，普通飼料］飼養(yǎng)外，其余各濕熱證UC模型組均置于高脂高糖飲食（糖15%、豬油10%、膽固醇4%、膽鹽0.3%、蛋黃粉10%、基礎飼料60.7%）及高溫（32±2）℃、高濕（95±2）%環(huán)境中，每日持續(xù)20 h。喂養(yǎng)4周后，用TNBS-乙醇灌腸法誘發(fā)濕熱型UC：給予腹腔注射100 g/L水合氯醛3 m L/kg進行麻醉，麻醉后使用直徑約為2 mm的硅膠管（可用7#頭皮針剪去針頭部分）灌腸，注入1 m L灌腸液（含100 mg TNBS 0.75 m L+500 m L/L乙醇0.25 m L），捏緊肛門并將大鼠臀部傾斜朝上約15 min，以防倒流；正常組同法灌入生理鹽水1 m L，讓動物保持平躺至自然清醒。在第3、7、14、21天時，分別處死模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠并取材，檢測大鼠疾病活動指數、組織大體形態(tài)學評分、IL-1β及IL-4的變化。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況 包括體質量、飲食、飲水、大便、毛發(fā)、活動、精神狀態(tài)等。

1.5.2 疾病活動指數（disease activity index，DAI）

造模后，觀察記錄大鼠的體質量、腹瀉和便血等臨床體征。參照JACKSON等［4］的方法計算（表1）。

表1 DAI的計算方法Tab.1 DAI calculation method

1.5.3 結腸黏膜損傷指數（colonic mucosa damage index，CMDI）評分 選取距肛門2.0 cm以上的結腸，沿腸系膜緣縱軸剪開腸腔，冰生理鹽水沖凈腸黏膜表面粘附物，選取結腸組織病變明顯處，于10倍放大鏡下觀察。參照BUTZER等［5］方法，根據粘連程度和炎癥、潰瘍形成情況進行結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分。粘連：0分無，1分輕度（結腸與其他組織剝離較易），2分重度；潰瘍形成及炎癥：0分無，1分局部充血無潰瘍，2分l處潰瘍不伴充血或腸壁增厚，3分l處潰瘍伴炎癥，4分大于2處潰瘍伴炎癥，5分大于2處潰瘍和/或炎癥大于1 cm，6～8分潰瘍和/或炎癥大于2 cm，病變范圍每增加1 cm，計分加1分。留取結腸標本分別用于HE染色。

1.5.4 血清IL-1β、IL-4檢測 所有大鼠末次給藥后，禁食不禁水24 h，給予100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血約5 m L，置于無菌試管中靜置2 h，以4 000 r/min離心10 min，留取血清待檢，-20℃冰箱待測。ELISA法測定各組大鼠血清IL-1β及IL-4的變化情況，檢測時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學處理用SPSS 17.0對數據進行統(tǒng)計學分析。檢測結果以ˉx±表示，多組樣本采用單因素方差分析，當方差齊時，兩兩比較選用LSD-t檢驗法；當方差不齊時，選用Tamhane-t檢驗法；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況正常組大鼠體質量穩(wěn)步增加，飲食飲水正常，大便呈顆粒狀，毛色光澤，動作敏捷，反應靈敏，精神狀態(tài)良好。各造模組大鼠前10 d體質量增加較快，后期變緩，懶動，毛發(fā)無華，大便黏滯不爽，糞色加深，尿黃，尿少。給予TNBS-乙醇灌腸后第1天均出現懶動、扎堆、弓背蜷臥、毛發(fā)晦暗無澤、飲食飲水減少、稀便，且部分大鼠出現潛血陽性或肉眼可見黏液膿血便，肛周體毛沾染痕跡多見；第3天體質量開始下降，懶動、扎堆現象較多；第7天體質量下降明顯，毛色無澤，飲食飲水低于正常，仍有稀便，部分大鼠仍為潛血陽性或肉眼可見黏液膿血便；第14天大鼠活動正常，仍有稀便，部分大鼠仍可見潛血陽性；第21天時大鼠毛色晦暗，飲食飲水趨于正常，偶有稀便。模型Ⅰ組于造模后第1天死亡1只，模型Ⅱ組于造模后第2天和第4天各死亡1只，模型Ⅲ組于造模后第1天死亡1只，模型Ⅳ組于造模后第3天死亡1只；正常組大鼠無死亡發(fā)生。

2.2 大鼠結腸黏膜情況

2.2.1 結腸肉眼觀 正常組結腸黏膜顏色呈現淡粉色，黏膜皺襞紋理清晰，表面光滑，未見明顯的充血、糜爛；模型Ⅰ組大鼠腸壁增厚，水腫明顯，腸腔黏膜充血點散在，潰瘍形成；模型Ⅱ組腸道黏膜顏色發(fā)黑，并有多處糜爛、潰瘍，結腸縮短，嚴重者可見腸穿孔；模型Ⅲ組潰瘍開始愈合，大鼠腸道仍然有粘連，偶可見腸脹氣；模型Ⅳ組可見少量糜爛，無潰瘍或可見潰瘍愈合的瘢痕。

2.2.2 結腸組織病理變化 正常組結腸黏膜完整，無潰瘍及糜爛形成。模型Ⅰ組大鼠腸黏膜充血，潰瘍形成，上皮細胞水腫、壞死，結腸全層增厚并可見大量炎癥細胞浸潤；模型Ⅱ組腸黏膜萎縮變薄，部分缺損、糜爛，且深達肌層，邊緣腺體壞死；模型Ⅲ組腸黏膜充血、水腫減輕，潰瘍變淺，散在炎癥細胞浸潤，肉芽組織增生；模型Ⅳ組腸黏膜相對完整，部分腺體破碎，周圍上皮下固有層中腺體增生且結構清晰、分泌活躍，肌層完整未見明顯異常（圖1）。

2.3 各組大鼠DAI、CMDI、血清IL-1β及IL-4的比較與正常組比較，濕熱證UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠DAI、CMDI、IL-1β含量明顯升高（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ組升高最為明顯（P＜0.01），模型Ⅰ、Ⅲ組升高較為明顯（P＜0.05），模型Ⅳ組盡管仍有所升高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；濕熱證UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠IL-4含量明顯下降（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ組降低最為明顯（P＜0.01），模型Ⅰ、Ⅲ組降低較為明顯（P＜0.05），模型Ⅳ組盡管仍有所降低，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表2）。

圖1 各組大鼠結腸組織的病理變化Eig.1 Pathological changes of colon tissue in each group（HE，×100）

表2 各組大鼠DAI、CMDI及血清IL-1β、IL-4的比較Tab.2 Comparison of DAI，CMDI and serum IL-1βand IL-4 in each group （±s）

表2 各組大鼠DAI、CMDI及血清IL-1β、IL-4的比較Tab.2 Comparison of DAI，CMDI and serum IL-1βand IL-4 in each group （±s）

與正常組比較，*P＜0.01，△P＜0.05。

組別例數DAI CMDI IL-1β（pg/mL）IL-4（pg/mL）正常組10 0.53±0.32 0.66±0.28 53.55±14.95 137.16±18.47模型Ⅰ組9 1.00±0.37△1.16±0.40△67.39±11.17△119.81±11.62△模型Ⅱ組8 3.17±0.31*3.54±0.49*79.38±7.79*97.50±10.76*模型Ⅲ組9 0.93±0.47△1.05±0.54△65.87±10.68△122.52±7.05△模型Ⅳ組0.59±0.46 0.81±0.26 56.7±16.59 132.21±15.42 9

3 討 論

UC是一種發(fā)病機制尚未完全明確的慢性非特異性結腸炎癥性疾病，且有癌變可能，近年來發(fā)病率和癌變率有明顯提高［6］。本病源于濕熱之邪蘊于大腸，與腸中氣血相搏結，致胃腸血絡受傷，氣血運行不暢，腸道傳導失司，腸絡受損，氣血凝滯，化腐成膿而出現黏液膿血便。辨證論治是中醫(yī)藥理論體系的精髓，醫(yī)家對本病的分型存在著諸多見解。李乾構［7］對60篇文獻進行統(tǒng)計分析后總結臨床分型可達42種，其出現順序依次為大腸濕熱型、脾虛濕熱型、脾胃虛弱型、脾腎陽虛型等。趙婕［8］對近10年文獻進行分類研究，發(fā)現UC大致可分為：大腸濕熱證、脾虛濕熱證、脾胃虛弱證、脾腎陽虛證、肝郁脾虛證、氣滯血瘀證、寒熱錯雜證等。可見對于UC的中醫(yī)辯證分型不統(tǒng)一，缺乏合理的辯證分型標準，目前影響力較大的是中國中西醫(yī)結合學會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會于2011在《潰瘍性結腸炎中西醫(yī)結合診療共識》［9］中頒布的，該共識將UC分為大腸濕熱證、脾氣虛弱證、脾腎陽虛證、肝郁脾虛證、寒熱錯雜證、熱毒熾盛證。但患者所表現的證候往往錯綜復雜，標準在臨床上的運用并不令人滿意。盡管分型不一，各類研究均表明大腸濕熱證在UC臨床中醫(yī)證型中以最為常見。呂永慧等［10］對110例UC患者進行中醫(yī)證型分布的研究，發(fā)現大腸濕熱證所占比例居首；趙新芳等［11］對60例UC進行內鏡表現與中醫(yī)辨證分型之間的研究表明，大腸濕熱型占55%，肝郁脾虛型占15%，血瘀腸絡占7%，脾胃氣虛型占3%，可見大腸濕熱為主要臨床證型。本研究是通過高脂高糖飲食及高溫高濕環(huán)境構建濕熱證大鼠模型，再結合TNBS-乙醇灌腸法誘發(fā)濕熱型UC，這是一種目前應用較為廣泛的構建濕熱證大鼠UC模型造模方案［12-13］。從本實驗的結果來看，各造模組大鼠出現體質量先增后降，懶動，毛發(fā)無華，大便黏滯不爽，糞色加深，尿黃、尿少等與人類濕熱證表現相似的癥狀。應用TNBS-乙醇灌腸后，大鼠出現潛血陽性或肉眼可見黏液膿血便，而結腸肉眼及鏡下均可見糜爛、潰瘍等潰瘍性結腸炎的癥狀，均可說明該法復制的濕熱證大鼠UC模型是成功的。

眾多研究表明，細胞因子在UC的發(fā)生、發(fā)展和轉歸的過程中，通過調節(jié)腸道炎癥免疫反應而使炎癥加重并持續(xù)存在，并引起腸組織慢性損傷，而腸道黏膜免疫系統(tǒng)中促炎細胞因子與抗炎細胞因子的失衡被認為是UC的重要發(fā)病機制。因此，本研究選取了促炎細胞因子IL-1β及IL-4抗炎細胞因子作為檢測指標，來探討其在濕熱證UC模型中的意義。

IL-1β與UC的發(fā)病密切相關［14］，它能介導UC早期的炎癥反應，刺激其它細胞因子和炎癥介質產生，還能反饋性地促進巨噬細胞和T淋巴細胞產生IL-2等表達進而加速炎癥反應，共同促進炎癥活性。IL-1β還可通過促進白細胞粘附分子的表達，使趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位，引發(fā)腸組織破壞和腸道的炎癥反應［15］。鐘江鵬等［16］指出，UC患者結腸黏膜中IL-1β在UC活動期明顯升高。張凱等［17］發(fā)現IL-1β在UC患者血清中水平隨著病情嚴重程度逐漸增加。曹秀紅等［18］研究也表明UC結腸黏膜組織中IL-1β水平可作為UC嚴重程度及療效的判斷指標。IL-4是一種重要的抗炎因子，主要由活化的巨噬細胞和淋巴細胞分泌，它能抑制單核巨噬細胞產生IL-1β、IL-6、IL-8和TNE-α等，并促進白細胞介素-1受體抗體（IL-1RA）的產生，提高IL-1RA/IL-1β的比例，在維持腸道免疫、抑制和消除腸道炎癥反應中發(fā)揮著非常重要的作用。WANG等［19］指出，IL-4在UC模型組的表達低于正常組；HUANG等［20］的研究也印證了這一點。岳文杰等［21］發(fā)現，IL-4不僅參與了UC的發(fā)病，并且其在腸黏膜局部的表達水平與疾病活動度呈正相關；林巧嫦等［22］研究也表明，UC患者IL-4濃度在不同分期、不同病情程度的差異有統(tǒng)計學意義。因而，IL-4的表達水平可用于評估UC的嚴重程度。正常狀態(tài)下，人體腸黏膜能自發(fā)的分泌抗炎因子如IL-4來維持腸道免疫，IL-1β則分泌較少或不分泌，二者之間維持著動態(tài)平衡，當遇到病原刺激后，則這種平衡遭到破壞，使促炎因子升高，抗炎因子降低，導致腸道炎癥發(fā)生。UC發(fā)生時，血清IL-1β升高、IL-4降低，已在臨床及實驗研究中得到了證實［23-24］。張學蘭［25］還揭示了促炎因子IL-1β隨著病情程度和病理分級升高而顯著升高，抗炎因子IL-4隨著病情程度和病理分級升高而顯著降低。

本實驗結果顯示，與正常組比較，濕熱證UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠IL-1β含量明顯升高（P＜0.01、P＜0.05），IL-4含量明顯下降，表明促炎因子IL-1β與抗炎因子IL-4的失衡和UC的發(fā)病密切相關；模型Ⅱ組IL-1β升高、IL-4下降均最為明顯（P＜0.01），表明此時腸黏膜炎性細胞因子失衡最為嚴重；模型Ⅰ、Ⅲ組IL-1β及IL-4的表達均說明炎癥處于發(fā)展或恢復階段，而模型Ⅳ組與正常組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），則說明腸黏膜炎性細胞因子平衡已經恢復，體現了機體自我調節(jié)和自我愈合能力。而DAI、CMDI結果也與上述結論一致。本實驗也證實抗炎和促炎細胞因子的失衡參與了UC的發(fā)病，因而從糾正腸道異常免疫反應角度探討UC藥物治療是一個重要思路。

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（編輯 卓選鵬）

The dynamic expression and significance of IL-1βand IL-4 in ulcerative colitis rats with damp-heat syndrome

ZHANG Xin1，KE Xiao2，CHEN Jin-tuan1，GAO You-liang2，ZHOU Ean3
（1.Clinical Skills Teaching Center，Eujian University of Traditional Chinese Medicine，Euzhou 350122；2.the Second Affiliated Hospital，Eujian University of Traditional Chinese Medicine，Euzhou 350003；3.Eujian Institute of Chinese Medicine，Euzhou 350003，China）

Objective To study the expressions of serum interleukin-1β（IL-1β）and interleukin-4（IL-4）in ulcerative colitis（UC）rats with damp-heat syndrome and explore their significance in assessing inflammatory severity.Methods We randomly divided 50 healthy Wistar rats of SPF grade（half males and half females）into normal group，and damp-heat syndrome model of UCⅠ（3 days），Ⅱ（7 days），Ⅲ（14 days）andⅣ（21 days）groups，with 10 in each group.Rats in normal group were raised in the natural environment of breeding，while those UC model groups with damp-heat syndrome were fed with high-sugar and high-fat food in the high-temperature and high-humidity environment for 4 weeks.The rat model of damp heat syndrome UC was established by using TNBS-ethanol enema.Then we detected the changes of disease activity index（DAI），colonic mucosa damage index（CMDI），IL-1βand IL-4 in each group.Results Compared with those in normal control group，DAI，CMDI and IL-1βlevels in damp heat syndrome UC modelⅠ，Ⅱ，Ⅲgroups were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05），with model groupⅡhaving the most obvious increase（P＜0.01）.Serum IL-4 level decreased significantly（P＜0.01，P＜0.05），with model groupⅡhaving the most significant decrease（P＜0.01）.The above indexes did not significantly differ in model groupⅣ（P＞0.05）.Conclusion Inflammatory cytokines IL-1βand IL-4 are involved in the pathogenesis of damp-heat syndrome UC.The increased IL-1βand decreased IL-4levels are consistentwith the time of inflammatory severity；therefore，they can be regarded as markers for assessing inflammatory severity in UC.

damp-heat syndrome；ulcerative colitis；disease activity index；colonic mucosa damage index；interleukin-1β；interleukin-4

R574.62

A

10.7652/jdyxb201505024

2014-09-22

2015-04-14

福建省自然科學基金項目（No.2011J01194），福建省中醫(yī)藥科研項目計劃項目（No.wzpw201309），福建中醫(yī)藥大學校管課題（No.X2012030）Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province（No.2011J01194），Fujian Province TCM Research Project（No. wzpw201309），and Fujian University of Traditional Chinese Medicine Project（No.X2012030）

柯曉.E-mail：drkxkx@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150717.1112.008.html（2015-07-17）