H2O2誘導(dǎo)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

馮 燕，張 波，王少蘭，王寶英，李紅波，杜芳英，俞小瑞

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)附屬

紅會(huì)醫(yī)院骨質(zhì)疏松科，陜西西安 710054；3.西安交通大學(xué)附屬3201醫(yī)院骨科，陜西漢中 723000）

◇基礎(chǔ)研究◇

H2O2誘導(dǎo)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

馮 燕1，2，張 波1，3，王少蘭1，王寶英1，李紅波1，杜芳英1，俞小瑞1

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)附屬

紅會(huì)醫(yī)院骨質(zhì)疏松科，陜西西安 710054；3.西安交通大學(xué)附屬3201醫(yī)院骨科，陜西漢中 723000）

目的 觀察H2O2誘導(dǎo)原代培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（［Ca2+］i）的變化及其來源。方法 取1～3 d內(nèi)新生SD大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，以100μmol/L H2O2作用0、2、4、8、12、24 h，采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，應(yīng)用Hoechst 33342染色法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，以Eluo-3 AM為細(xì)胞內(nèi)Ca2+探針并利用熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)（EACS）進(jìn)行［Ca2+］i檢測(cè)，確定H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡過程中［Ca2+］i的變化；應(yīng)用細(xì)胞外Ca2+螯合劑EGTA初步檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的［Ca2+］i變化是否源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。結(jié)果 100μmol/L H2O2可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡數(shù)目呈時(shí)間依賴性遞增；100μmol/L H2O2作用2～24 h均可顯著降低細(xì)胞活力，而［Ca2+］i的升高出現(xiàn)在H2O2作用2 h且維持至12 h，然后逐漸下降，至24 h恢復(fù)至正常水平；0.5～5 mmol/L EGTA可顯著削弱由100μmol/L H2O2作用2 h導(dǎo)致的［Ca2+］i增加。結(jié)論 在H2O2誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中，［Ca2+］i的升高發(fā)生在凋亡的早期階段，而非細(xì)胞凋亡全過程中；H2O2的損傷作用所導(dǎo)致的［Ca2+］i升高部分來源于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。

［Ca2+］i；H2O2；SD大鼠；視網(wǎng)膜細(xì)胞；凋亡

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器多聚賴氨酸、Hoechst 33342由Sigma公司提供，DMEM/E-12培養(yǎng)液由Hyclone公司提供，胎牛血清由杭州四季青公司提供，H2O2由西安試劑廠提供，胰酶、DMSO、MTT、EGTA（extracellular Ca2+chelator）由Ameresco公司提供，Eluo-3 AM、20%Pluronic E-127由Biotium公司提供；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板由Costar corporation提供；實(shí)驗(yàn)用相關(guān)基本試劑及實(shí)驗(yàn)耗材均購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)耗材供應(yīng)中心；實(shí)驗(yàn)用二氧化碳培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀、解剖顯微鏡、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱等儀器均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；流式細(xì)胞儀由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞原代培養(yǎng)取3 d內(nèi)新生SD大鼠10只（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量5～12 g），解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織，2.5 g/L胰酶消化10 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/m L，以1 000μL/孔接種到鋪有多聚賴氨酸的24孔板內(nèi)，于含100 m L/L胎牛血清的DMEM/E-12培養(yǎng)液，37℃50 m L/L的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24 h全量或半量換液。第1～9天分別應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，明確細(xì)胞生長的最佳時(shí)期即第5～6天細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 H2O2干預(yù)及形態(tài)學(xué)觀察在原代培養(yǎng)第5天

時(shí)用100μmol/L的H2O2干預(yù)，分別作用0、2、4、8、12、24 h，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力0、25、50、100、150、200

μmol/L的H2O2作用2 h或以100μmol/L的H2O2作用0、2、4、8、12、24 h，加入5 mg/m L的MTT（1 m L培養(yǎng)液加入100μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，加入750μL的DMSO，37℃搖床振蕩10 min充分溶解紫色甲臜晶體產(chǎn)物；全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處的吸光度值；計(jì)算細(xì)胞活力。空白對(duì)照為無接種細(xì)胞，每孔的實(shí)際吸光值為檢測(cè)值減去空白對(duì)照孔的吸光值。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值。

1.5 Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（不干預(yù)）和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)100μmol/L的H2O2刺激0～24 h；2.5 g/L的胰酶消化、收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，將細(xì)胞懸液40μL滴片，用40 g/L多聚甲醛固定20 min；室溫下與2μg/m L的Hoechst 33342熒光染料避光孵育10 min；PBS洗滌2次；以激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為510 nm，熒光顯微鏡下進(jìn)行凋亡檢測(cè)并計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇含有100個(gè)細(xì)胞的3～5個(gè)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組樣本的凋亡細(xì)胞數(shù)為該組所有復(fù)孔隨機(jī)選擇的視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.6 熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)（FACS）進(jìn)行［Ca2+］i檢測(cè)［14-16］細(xì)胞分別經(jīng)以下干預(yù)處理：①0、25、50、100、150、200μmol/L的H2O2作用2 h；②100μmol/L的H2O2作用0、2、4、8、12、24 h；③0.1、0.2、0.5、1、2、5 mmol/L的EGTA預(yù)處理1 h，然后100μmol/L的H2O2作用2 h。同上收集細(xì)胞并用PBS（不含Ca2+）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/m L；細(xì)胞懸液300μL，加入5μmol/L的Eluo-3 AM 100μL（用5 mmol/L的Eluo-3 AM儲(chǔ)存液配制），37℃，避光孵育30 min；1 000 r/min，離心5 min，棄上清；用500μL PBS（不含Ca2+）洗滌細(xì)胞2次；應(yīng)用EACS技術(shù)，選擇526 nm為發(fā)射波長、488 nm為激發(fā)波長，進(jìn)行［Ca2+］i檢測(cè)。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇含有10 000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群為檢測(cè)對(duì)象。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。未加Eluo-3AM的設(shè)為空白對(duì)照。由于幾何平均熒光值的正態(tài)分布性較好，因此將其用于數(shù)據(jù)分析，空白對(duì)照以E0表示，其他檢測(cè)組以E1表示。每個(gè)樣本的Eluo-3 AM實(shí)際熒光值（以E表示）須檢測(cè)值減去空白對(duì)照（即E=E1-E0）。統(tǒng)計(jì)分析處理時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，［Ca2+］i用“實(shí)驗(yàn)組的平均E值/對(duì)照組的平均E值”表示，此時(shí)將對(duì)照組的［Ca2+］i標(biāo)準(zhǔn)化為1。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均進(jìn)行4次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 光學(xué)顯微鏡下原代培養(yǎng)1～9 d的SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Eig.1 Morphological observation of retinal cells of primary cultured SD rats on 1-9 d under optical microscope（×400）

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜細(xì)胞生長狀態(tài)觀察原代培養(yǎng)1～9 d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞成簇生長，且逐漸出現(xiàn)突觸連接。細(xì)胞第5～6天生長最旺盛而且生長狀態(tài)最穩(wěn)定。之后，在沒有任何損傷因素的情況下，細(xì)胞會(huì)自發(fā)產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象（圖1）。因此，原代培養(yǎng)的第5～6天是進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間。

2.2 視網(wǎng)膜細(xì)胞在H2O2作用各時(shí)間點(diǎn)的凋亡情況Hoechst 33342染色顯示（圖2），100μmol/L H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡最早出現(xiàn)在作用4 h，且凋亡細(xì)胞數(shù)呈時(shí)間依賴性逐漸增加。

2.3 H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡中［Ca2+］i的變化25～200μmol/L的H2O2作用2 h可以降低視網(wǎng)膜細(xì)胞活力，且呈濃度依賴性；與對(duì)照組相比，100～200 μmol/L的H2O2可顯著降低細(xì)胞活力（圖3A）。100 μmol/L H2O2作用隨著時(shí)間延長，成簇生長的細(xì)胞逐漸變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞，細(xì)胞間突觸連接逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，貼壁生長的細(xì)胞逐漸脫落懸浮，最后發(fā)生細(xì)胞凋亡（圖4），作用2～24 h均可顯著降低視網(wǎng)膜細(xì)胞活力，且呈時(shí)間依賴性降低（圖5A）。

25、50μmol/L H2O2作用2 h對(duì)［Ca2+］i無明顯影響，100、150、200μmol/L的H2O2作用2 h可顯著升高［Ca2+］i，且為劑量依賴性增加（圖3中B、C、D）。100μmol/L的H2O2作用2、4、8、12 h，均可使［Ca2+］i顯著升高，且2 h和4 h時(shí)［Ca2+］i升高最為顯著，之后逐漸下降，至24 h恢復(fù)到正常水平（圖5中B、C、D）；與對(duì)照組相比，作用2 h輕度降低細(xì)胞活力而顯著增加［Ca2+］i（P＜0.001），作用24 h顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.001）而［Ca2+］i無明顯變化（圖5中A、B）。

圖2 H2O2作用于視網(wǎng)膜細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的Hoechst 33342染色結(jié)果Eig.2 Apoptosis of retinal cells of primary cultured SD rats at different time points after H2O2stressing

圖3 0～200μmol/L的H2O2作用2 h對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞活力和［Ca2+］i的影響Eig.3 Effects of 0-200μmol/L H2O2treatment for 2 h on cell viability and［Ca2+］iof retinal cells of primary cultured SD rats

圖4 100μmol/L H2O2作用不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Eig.4 Morphological changes of retinal cells of primary cultured SD rats treated with 100μmol/L of H2O2for different time（×400）

圖5 100μmol/L H2O2作用不同時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞活力和［Ca2+］i的影響Eig.5 Effects of 100μmol/L H2O2treatment for different time on cell viability and［Ca2+］iof retinal cells of primary cultured SD rats

圖6 EGTA對(duì)100μmol/L H2O2導(dǎo)致的視網(wǎng)膜細(xì)胞［Ca2+］i變化的影響Eig.6 Effects of EGTA on 100μmol/L H2O2-induced［Ca2+］ialteration of primary cultured SD rat retinal cells

2.4 細(xì)胞外Ca2+螯合劑EGTA對(duì)H2O2引發(fā)的視網(wǎng)膜細(xì)胞［Ca2+］i升高的影響0.5～5.0 mmol/L EGTA顯著削弱了100μmol/L H2O2作用2 h導(dǎo)致的［Ca2+］i的增加，且呈劑量依賴性（圖6）。

3 討 論

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，位于眼的后方，包含較少基本類型的細(xì)胞，其中色素上皮細(xì)胞和光感受器之間幾乎沒有緊密的細(xì)胞粘連，使得視網(wǎng)膜可容易地與眼后組織完整分離。故易于操作并完整地從眼球后部取下，而從冷血脊椎動(dòng)物分離的視網(wǎng)膜在濕潤有氧的環(huán)境中可存活數(shù)小時(shí)。此外，人工培養(yǎng)基可使動(dòng)物視網(wǎng)膜維持更長時(shí)間。因此，視網(wǎng)膜特殊的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和容易在體外培養(yǎng)存活的生長特點(diǎn)，使其成為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想模型。

視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層中的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞具有高度光感性，使得視網(wǎng)膜易于遭受光刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，成為視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。視網(wǎng)膜退行性疾病是臨床眼科常見疾病之一，常因最終致盲而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，研究視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究的一個(gè)良好的體外模型。體外模型被廣泛用于研究疾病的發(fā)病機(jī)制。原代細(xì)胞培養(yǎng)早已成為體外研究最為廣泛使用的視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)方法［17］?；旌显囵B(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞包括各種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞，與細(xì)胞系相比能夠更好地代表在體水平。本研究所得數(shù)據(jù)均基于H2O2誘導(dǎo)的原代混合培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡模型，可以代表多種視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)病機(jī)制。

［Ca2+］i在多數(shù)細(xì)胞生命活動(dòng)過程中起著重要作用，受機(jī)體內(nèi)一系列復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控。雖然短暫的［Ca2+］i升高是機(jī)體基本生命過程中維持細(xì)胞膜興奮性所必需的，但是慢性［Ca2+］i升高卻會(huì)觸發(fā)毒性信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近年研究證據(jù)表明，在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中都存在有［Ca2+］i異常。大量的研究顯示，［Ca2+］i變化可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］，提示了［Ca2+］i相關(guān)機(jī)制與細(xì)胞凋亡之間存在一定的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，該凋亡過程是由［Ca2+］i的增加介導(dǎo)的。存在于細(xì)胞質(zhì)膜上的離子通道、泵和交換體時(shí)刻門控著細(xì)胞內(nèi)Ca2+的進(jìn)入和釋放，從而嚴(yán)格調(diào)控［Ca2+］i，以維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號(hào)刺激時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致高達(dá)100倍的［Ca2+］i的增加，這些增加的［Ca2+］i來源于細(xì)胞攝取胞外Ca2+的進(jìn)入或胞內(nèi)鈣褲釋放的Ca2+。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個(gè)Ca2+通道參與H2O2介導(dǎo)的［Ca2+］i增加，包括NMDA受體、AMPA受體和VGCC［19-21］。TRP蛋白家族是一組非電壓依賴性陽離子滲透的Ca2+通道，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)，包括6個(gè)亞家族：TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML［22-23］。最近的證據(jù)表明，通過TRP通道使得Ca2+內(nèi)流增加是氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞死亡的一個(gè)重要機(jī)制；氧化應(yīng)激可以激活TRPC和TRPM家族成員［23］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Ca2+在H2O2誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著一定的作用，且［Ca2+］i的增加出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡的早期階段，而不是在凋亡的后期。此外，增加的［Ca2+］i部分來源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，有關(guān)調(diào)控H2O2誘導(dǎo)原代培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡早期［Ca2+］i增加的詳盡分子機(jī)制正在深入進(jìn)行中。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+指示劑和［Ca2+］i檢測(cè)方法有多種，適當(dāng)?shù)闹甘緞┖蜋z測(cè)方法的選擇對(duì)［Ca2+］i檢測(cè)結(jié)果和研究結(jié)論是非常重要的。目前，常用的細(xì)胞內(nèi)Ca2+指示劑有Eluo-3、Eura-2和Indo-1等。常用的［Ca2+］i檢測(cè)方法有激光共聚焦、鈣顯像、EACS等。20多年前Eluo-3已被廣泛應(yīng)用于［Ca2+］i檢測(cè)的Ca2+熒光探針［15］。在沒有Ca2+存在的情況下，Eluo-3無熒光可見，但當(dāng)與Ca2+結(jié)合時(shí)，Eluo-3在發(fā)射波長為526 nm處的熒光強(qiáng)度至少增強(qiáng)40倍以上。Eluo-3與Eura-2、Indo-1的不同之處是它的最大激發(fā)和發(fā)射熒光在與Ca2+結(jié)合前后都不會(huì)有明顯的變化。因此，Eluo-3不適用于鈣顯像比率技術(shù)檢測(cè)［Ca2+］i，而是EACS技術(shù)檢測(cè)［Ca2+］i最合適的細(xì)胞內(nèi)Ca2+探針之一。然而，雖然Eluo-3靈敏度很高，是EACS檢測(cè)［Ca2+］i最合適的細(xì)胞內(nèi)Ca2+探針之一，但只有少數(shù)細(xì)胞對(duì)其有通透性，從而限制了很多種類細(xì)胞的［Ca2+］i檢測(cè)。隨后人們發(fā)現(xiàn)Eluo-3 AM是酯膜滲透性Eluo-3，可以通過大多數(shù)細(xì)胞膜而被動(dòng)擴(kuò)散。Eluo-3 AM本身不與Ca2+結(jié)合，但當(dāng)其一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被水解為Eluo-3，可以與Ca2+結(jié)合［16］。由此可見，本研究選用Eluo-3 AM為細(xì)胞內(nèi)Ca2+指示劑，采用EACS技術(shù)檢測(cè)［Ca2+］i是合理可行的，Eluo-3 AM的熒光強(qiáng)度能夠真實(shí)反應(yīng)［Ca2+］i實(shí)時(shí)變化。

因此，本研究應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)的原代混合培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡為模型，以Eluo-3AM為細(xì)胞內(nèi)Ca2+探針，利用EACS技術(shù)檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡過程中［Ca2+］i的變化，能夠真實(shí)反應(yīng)多種視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，具有一定的理論意義。今后將進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

［1］SELVARAJ S，SUN Y，SINGH BB.TRPC channels and their implication in neurological diseases［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2010，9（1）：94-104.

［2］ORRENIUS S，ZHIVOTOVSKY B，NICOTERA P.Regulation of cell death：the calcium-apoptosis link［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（7）：552-565.

［3］NGUYEN TT，CHO SO，BAN JY，et al.Neuroprotective effect of Sanguisorbae radix against oxidative stress-induced brain damage：in vitro and in vivo［J］.Biol Pharm Bull，2008，31（11）：2028-2035.

［4］BERRIDGE MJ，BOOTMAN MD，LIPP P.Calcium—a life and death signal［J］.Nature，1998，395（6703）：645-648.

［5］CAO W，TOMBRAN-TINK J，CHEN W，et al.Pigment epithelium-derived factor protects cultured retinal neurons against hydrogen peroxide-induced cell death［J］.J Neurosci Res，1999，57（6）：789-800.

［6］CLEMENT MV，PONTON A，PERVAIZ S.Apoptosis induced by hydrogen peroxide is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of intracellular milieu［J］.FEBS Lett，1998，440（1-2）：13-18.

［7］BERLIOCCHI L，BANO D，NICOTERA P.Ca2+signals and death programmes in neurons［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2005，360（1464）：2255-2258.

［8］ARUNDINE M，TYMIANSKI M.Molecular mechanisms of glutamate-dependent neurodegeneration in ischemia and traumatic brain injury［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61（6）：657-668.

［9］WU S，HYRC KL，MOULDER KL，et al.Cellular calcium deficiency plays a role in neuronal death caused by proteasome inhibitors［J］.J Neurochem，2009，109（5）：1225-1236.

［10］JOHNSON EM，JR.，KOIKE T，F(xiàn)RANKLIN J.A“calcium set-point hypothesis”of neuronal dependence on neurotrophic factor［J］.Exp Neurol，1992，115（1）：163-166.

［11］MO MS，LI HB，WANG BY，et al.PI3K/Akt and NF-kappaB activation following intravitreal administration of 17beta-estradiol：neuroprotection of the rat retina from light-induced apoptosis［J］.Neuroscience，2013，228：1-12.

［12］LI H，WANG B，ZHU C，et al.17beta-estradiol impedes Baxinvolved mitochondrial apoptosis of retinal nerve cells induced by oxidative damage via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signal pathway［J］.J Mol Neurosci，2013，50（3）：482-493.

［13］YU X，RAJALA RV，MCGINNIS JF，et al.Involvement of insulin/phosphoinositide 3-kinase/Akt signal pathway in 17 beta-estradiol-mediated neuroprotection［J］.J Biol Chem，2004，279（13）：13086-13094.

［14］ARROBA AI，WALLACE D，MACKEY A，et al.IGF-I maintains calpastatin expression and attenuates apoptosis in several models of photoreceptor cell death［J］.Eur J Neurosci，2009，30（6）：975-986.

［15］KAO JP，HAROOTUNIAN AT，TSIEN RY.Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3［J］.J Biol Chem，1989，264（14）：8179-8184.

［16］TAKAHASHI A，CAMACHO P，LECHLEITER JD，et al. Measurement of intracellular calcium［J］.Physiol Rev，1999，79（4）：1089-1125.

［17］SEIGEL GM.The golden age of retinal cell culture［J］.Mol Vis，1999，5：4.

［18］NOGUCHI A，TAKADA M，NAKAYAMA K，et al.c GMP-independent anti-apoptotic effect of nitric oxide on thapsigargin-induced apoptosis in the pancreatic beta-cell line INS-1［J］. Life Sci，2008，83（25-26）：865-870.

［19］DUNCAN RS，GOAD DL，GRILLO MA，et al.Control of intracellular calcium signaling as a neuroprotective strategy［J］. Molecules，2010，15（3）：1168-1195.

［20］LEE HJ，BAN JY，SEONG YH.Blockade of 5-HT（3）receptor with MDL7222 and Y25130 reduces hydrogen peroxide-induced neurotoxicity in cultured rat cortical cells［J］.Life Sci，2005，78（3）：294-300.

［21］HERSON PS，LEE K，PINNOCK RD，et al.Hydrogen peroxide induces intracellular calcium overload by activation of a non-selective cation channel in an insulin-secreting cell line［J］. J Biol Chem，1999，274（2）：833-841.

［22］CLAPHAM DE.TRP channels as cellular sensors［J］.Nature，2003，426（6966）：517-524.

［23］CLAPHAM DE.Calcium signaling［J］.Cell，2007，131（6）：1047-1058.

（編輯 國 榮）

Alteration of intracellular calcium concentration in the process of H2O2-induced apoptosis of SD rat retinal cells

EENG Yan1，2，ZHANG Bo1，3，WANG Shao-lan1，WANG Bao-ying1，LI Hong-bo1，DU Eang-ying1，YU Xiao-rui1

（1.Department of Genetics and Molecular Biology，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061；2.Department of Osteoporosis，the Red Cross Hospital Affiliated to Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710054；3.Department of Orthopedics，3201 Hospital Affiliated to Xi'an Jiaotong University，Hanzhong 723000，China）

Objective To observe the alteration of intracellular Ca2+concentration（［Ca2+］i）in the process of H2O2-induced apoptosis of retinal cells and to detect the source of［Ca2+］ion the in vitro model of primary cultured SD rat retinal cells.Methods In this study，we used primary cultured retinal cells as experimental model，detected the［Ca2+］iby FACS technique with Fluo-3 AM as a Ca2+indicator.Cell viability was measured by MTT. Apoptosis was assayed by Hoechst 33342 staining.Besides，we used extracellular Ca2+chelator EGTA to preliminarily determine whether the alteration of［Ca2+］isourced from Ca2+influx or not.Results H2O2of 100 μmol/L could induce the apoptosis of primary cultured SD rat retinal cells in a time-dependent manner.Cell viability of primary cultured retinal cells was reduced time dependently from 0 h to 24 h after 100μmol/L H2O2stressed，but［Ca2+］iincreased at 2 h，sustained to 12 h，and then recovered gradually.Increased［Ca2+］icaused by 100μmol/L H2O2treatment for 2 h significantly attenuated by 0.5-5 mmol/L EGTA，which was dose-dependent.Conclusion［Ca2+］iincrease occurred at the early stage of primary cultured SD rat retinal cells apoptosis induced by H2O2.The increase of［Ca2+］isourced partly from extracellular Ca2+influx.

［Ca2+］i；H2O2；SD rat；retinal cell；apoptosis Ca2+在細(xì)胞各種生命活動(dòng)中起著重要作用［1-2］，不同條件下［Ca2+］i的變化復(fù)雜多樣。退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中，［Ca2+］i過度升高或降低均有著重要作用［3-4］；氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)。H2O2可以誘導(dǎo)各種細(xì)胞發(fā)生凋亡，并早已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究的體外模型［4-6］。許多研究報(bào)道，氧化應(yīng)激導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中［Ca2+］i增加的作用［7-8］，但近年來也有報(bào)道神經(jīng)退行性疾病中［Ca2+］i減少的作用［9-10］。這些不同的研究結(jié)果，可能是由于Ca2+時(shí)間和空間特異性所造成的。近年來，相繼出現(xiàn)應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的體外模型，進(jìn)行視網(wǎng)膜退行性疾病的研究［11-13］。但有關(guān)Ca2+在視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的研究較少。本研究旨在檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)原代培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過程中［Ca2+］i變化及其來源，以期為闡明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)，并為視網(wǎng)膜退行性疾病尋求明確的防治靶點(diǎn)。

R774.1

A

10.7652/jdyxb201505002

2014-12-05

2015-05-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81271013）；國家教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（No.20120201110051）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81271013）and the National Research Foundation for the Doctoral Program of Higher Education of China（No.2012020111005）

俞小瑞.E-mail：xiaoruiy@mail.xjtu.edu.cn.馮燕、張波為共同第一作者.

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150805.1252.002.html（2015-08-05）