清開靈硬膠囊和軟膠囊中黃芩苷的大鼠藥代動力學(xué)比較研究

張靖悅，江云霞，劉 卉，陳秋宇，蓋聰昊，許 卉

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺264005)

清開靈硬膠囊和軟膠囊中黃芩苷的大鼠藥代動力學(xué)比較研究

張靖悅，江云霞，劉 卉，陳秋宇，蓋聰昊，許 卉

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺264005)

研究2種不同清開靈膠囊制劑中重要藥效成分黃芩苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，為清開靈制劑的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).健康雄性大鼠隨機(jī)分為2組，每組6只，分別灌胃給予清開靈膠囊和軟膠囊，給藥劑量按黃芩苷計均為60 mg/kg.于不同時間點(diǎn)采集血漿樣品，HPLC法測定血漿中黃芩苷藥物濃度，根據(jù)藥-時曲線計算主要藥動學(xué)參數(shù)，并比較組間差異.黃芩苷血漿藥物濃度在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，方法準(zhǔn)確度與精密度良好，適用于血漿黃芩苷藥物濃度測定.在相同給藥劑量下，清開靈軟膠囊和膠囊給藥后大鼠血漿黃芩苷的Tmax分別為1.5±0.2 h、2.0±0.3 h，Cmax分別為1.72±0.24 μg/mL、1.10±0.16 μg/mL，AUC分別為11.76±1.53(mg/L)·h、7.58 ±0.89(mg/L)·h、MRT分別為7.25±0.88 h、5.10±0.69 h，均存在顯著的組間差異(P＜0.05).與硬膠囊制劑相比，清開靈軟膠囊在大鼠體內(nèi)的黃芩苷藥動學(xué)上顯示明顯優(yōu)勢，可能是一種更具治療優(yōu)勢的清開靈口服制劑.

清開靈;膠囊制劑;黃芩苷;藥代動力學(xué);高效液相色譜法

清開靈是在中醫(yī)治療急性熱病傳統(tǒng)處方“溫病三寶”中的安宮牛黃丸配方基礎(chǔ)上改良而成的純中藥復(fù)方制劑，由牛黃、水牛角、珍珠母、黃芩、桅子、金銀花、板藍(lán)根等7味中藥組成.全方以苦寒、甘寒、咸寒并用，達(dá)到清熱解毒、瀉火除煩、化痰通絡(luò)、醒神開竊之功效，主要用于外感熱證、實(shí)證、痰熱、癖血為主之病證，尤其對缺血性中風(fēng)、急性上呼吸道感染、全身炎癥反應(yīng)綜合征以及急救中毒等內(nèi)科急癥起效快，療效顯著，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合臨床［1-2］.

清開靈方在20世紀(jì)70年代首先以注射液成功研制，并成為國家首批公布的中藥保護(hù)品種和急癥必備中成藥［3］.2001年11月，國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心首次通報了清開靈注射劑引起的過敏反應(yīng)，隨著臨床應(yīng)用不斷擴(kuò)展，其嚴(yán)重不良反應(yīng)事件報告也日益增多［4-5］.以提高安全性為目標(biāo)的各種清開靈口服劑型研發(fā)因此引起廣泛關(guān)注，目前已形成由口服液、顆粒、滴丸、分散片、泡騰片、膠囊、軟膠囊等諸多口服制劑組成的清開靈產(chǎn)品系列［6］，多為現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(一部)［7］收載.其中，清開靈軟膠囊是神威藥業(yè)的獨(dú)家品種.

盡管各種清開靈口服制劑組方基本相同，但輔料和生產(chǎn)工藝的不同，可能導(dǎo)致不同劑型在吸收、代謝、排泄以及作用機(jī)理和不良反應(yīng)上的差異，臨床使用也應(yīng)隨之調(diào)整.但目前這方面的研究較少，特別是不同口服劑型間藥動學(xué)的比較研究尚未見文獻(xiàn)報道.黃芩苷是清開靈方中含量最高的質(zhì)量控制成分，也是其藥效指標(biāo)成分［8-10］.本研究以其黃芩苷為對象，首次針對當(dāng)前臨床應(yīng)用廣泛的2種清開靈口服膠囊制劑——普通硬膠囊和軟膠囊中黃芩苷的體內(nèi)藥代動力學(xué)過程進(jìn)行比較，以期為清開靈口服新制劑的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國，二元高壓泵，VWD檢測器)，TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司).

黃芩苷對照品、內(nèi)標(biāo)槲皮素均由中國藥品生物制品檢定所提供，純度大于99.5%，清開靈膠囊(廣州白云山明興制藥有限公司，每粒裝0.25 g，含黃芩苷10 mg，批號:120956)，清開靈軟膠囊(神威藥業(yè)有限公司，每粒裝0.4 g，含黃芩苷20 mg，批號: 12032911)，甲醇(色譜純，北京百靈威科技有限公司)，其余均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

健康SD大鼠，雄性，體重220±20 g，山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020.

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液配制

精密稱取黃芩苷10 mg，用甲醇溶解定容制得1 mg/mL黃芩苷對照品溶液.同時精密稱取內(nèi)標(biāo)槲皮素10 mg，用甲醇溶解定容，制得1 mg/mL槲皮素溶液.上述溶液置4℃冰箱保存，備用.對照品溶液在臨用前用甲醇稀釋，制備所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液.

2.2 血漿樣品采集

SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只，給藥前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予清開靈膠囊和清開靈軟膠囊內(nèi)容物的0.5%CMC-Na混懸液，劑量以黃芩苷計均為60 mg/kg［11-12］.分別于給藥前及給藥后0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血約0.3 mL，置肝素處理的離心管中，立即于4℃8 000 r/min離心10 min(當(dāng)血漿樣品采集的轉(zhuǎn)速小于8 000 r/min時，上清液和沉淀分離效果不佳，上清液不容易吸取)［13-14］.精確吸取上層血漿100 μL于EP管中，置-80℃冰箱中保存待測.

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動相甲醇-水(含0.2%磷酸)47∶53(V/V)，流速1 mL/min，檢測波長278 nm，進(jìn)樣量20 μL.

2.4 血漿樣品預(yù)處理與專屬性考察

取100 μL空白血漿，先后加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，渦旋震蕩30 s，加入20 μL 3 mol/L HCl和100 μL乙腈，渦旋震蕩1 min，超聲1 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析.同法處理空白血漿、僅加入黃芩苷對照品的空白血漿以及給藥大鼠血漿樣品，分別測定并記錄色譜圖，如圖1所示.結(jié)果表明，在所建立的色譜條件下，黃芩苷和槲皮素的色譜保留時間分別為13 min和18 min，二者分離度良好，且均不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，適用于含藥血漿樣品中黃芩苷血藥濃度的測定.

圖1 HPLC法測定大鼠血漿黃芩苷藥物濃度的典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC chromatograms for assay of baicalin in rat plasma

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取空白血漿100 μL，加入黃芩苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，渦旋混勻，制成含黃芩苷分別為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10 μg/mL的血漿樣品，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，然后按2.4項(xiàng)下方法處理后測定.以黃芩苷與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值Y對黃芩苷的血漿藥物濃度X采用加權(quán)最小二乘法(1/X2為權(quán))進(jìn)行線性回歸，得典型的回歸方程為Y=27.018X+ 0.014(r=0.999 1).結(jié)果表明，黃芩苷的血漿藥物濃度在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢出限和最低定量限分別為0.015 μg/mL、0.05 μg/mL.

2.6 回收率試驗(yàn)

取空白大鼠血漿100 μL，加入黃芩苷對照品溶液10 μL，分別配制低(0.1 μg/mL)、中(1 μg/mL)、高(10 μg/mL)濃度的質(zhì)控(QC)樣品各6份，按2.4項(xiàng)下方法處理后測定黃芩苷的色譜峰面積，并與未經(jīng)提取處理的相同濃度黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積相比，計算得3個濃度下血漿中黃芩苷的提取回收率分別為(89.5±3.0)%、(93.3±2.1)%、(91.6±1.4)%.結(jié)果表明，所建立的樣品處理方法對血漿中黃芩苷具有穩(wěn)定較高的提取回收率，適用于黃芩苷血藥濃度測定的樣品處理.

2.7 精密度試驗(yàn)

取空白大鼠血漿100 μL，加入黃芩苷對照品溶液10 μL，分別配制低(0.1 μg/mL)、中(1 μg/mL)、高(10 μg/mL)濃度的QC樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理后測定，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度.在同1 d內(nèi)分別測定5次，計算日內(nèi)精密度;每天測定一次，連續(xù)測定5 d，計算日間精密度.結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均小于5%，符合生物樣品測定要求.

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取空白大鼠血漿100 μL，加入黃芩苷對照品溶液10 μL，分別配制低(0.1 μg/mL)、中(1 μg/mL)、高(10 μg/mL)濃度的QC樣品各6份，按2.4項(xiàng)下方法處理后測定，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，并計算濃度測定值與理論值的比值，即相對回收率.結(jié)果低、中、高3個質(zhì)量濃度的相對回收率分別為(101.5 ±3.4)%、(100.2±2.5)%、(98.9±2.7)%，均在85%～115%范圍內(nèi)，表明準(zhǔn)確度符合生物樣品測定要求.

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白大鼠血漿100 μL，加入黃芩苷對照品溶液10 μL，分別配制低(0.1 μg/mL)、中(1 μg/mL)、高(10 μg/mL)濃度的QC樣品各3份，分別于室溫下放置12 h、-20℃冷凍保存7 d、-20℃冷凍保存24 h后室溫融化，然后按2.4項(xiàng)下方法處理后測定，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，重復(fù)操作3次.結(jié)果濃度測定值與理論值間的相對偏差(RE)＜5%，表明黃芩苷含藥血漿樣品在上述條件下保存和測定是可行的.

2.10 藥時曲線及藥動學(xué)參數(shù)

2組大鼠在分別灌胃給予清開靈膠囊和清開靈軟膠囊后，將各時間點(diǎn)采集的血漿樣品按2.4項(xiàng)下方法處理后測定，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃芩苷的血藥濃度，繪制平均血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖2.進(jìn)一步采用DAS2.1藥動學(xué)軟件對黃芩苷的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算主要藥動學(xué)參數(shù)，并采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異比較，結(jié)果見表1.

圖2 SD大鼠灌胃不同清開靈膠囊制劑的黃芩苷血漿藥-時曲線(n=6)Fig.2 Plasma baicalin concentration-time curve in rats by intragastric administration of different Qingkailing capsules(n=6)

表1 SD大鼠灌胃不同清開靈膠囊制劑的黃芩苷動力學(xué)參數(shù)(Mean±SD，n=6)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of baicalin by intragastric administration different capsule to SD rats (Mean±SD，n=6)

3 討論

3.1 血漿樣品的保存與處理方法

黃芩苷化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，其分子結(jié)構(gòu)中的苷鍵易水解、鄰二酚羥基易氧化，這些反應(yīng)在弱酸性條件下被抑制，在堿性及高溫條件下則被催化［15］.黃芩苷在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，但在血漿、磷酸緩沖鹽的組織勻漿液等生物樣品中不穩(wěn)定［8］.因此，本研究選擇在血樣采集后立即于低溫(4℃)下離心分離血漿，并置-80℃冰箱中保存，以保證含藥血漿中黃芩苷的穩(wěn)定性.

在溶解性上，黃芩苷易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯［16］.因此，本研究以回收率為指標(biāo)，分別考察了蛋白沉淀法(甲醇、乙腈)和乙酸乙酯溶劑萃取法對血漿樣品分析前的預(yù)處理效果.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取處理的黃芩苷提取回收率較低(＜50%)，且隨血漿藥物濃度變化有較大波動;采用甲醇沉淀蛋白時，內(nèi)源性物質(zhì)對分析物和內(nèi)標(biāo)的色譜峰有明顯的干擾，特別對于低濃度樣品的測定結(jié)果有較大影響;當(dāng)用乙腈沉淀時，血漿的內(nèi)源性物質(zhì)幾乎無干擾.因此，本研究選擇以乙腈沉淀蛋白處理血漿樣品，并提前加入適量HCl溶液，以提高蛋白沉淀效率，同時維持酸性環(huán)境以保證血漿中黃芩苷的穩(wěn)定性.進(jìn)一步的方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究建立的血漿樣品保存和處理方法，在穩(wěn)定性、回收率和準(zhǔn)確度等指標(biāo)上均符合藥典對于生物樣品測定的要求，適用于血漿黃芩苷藥物濃度測定.

3.2 2種清開靈膠囊制劑的藥動學(xué)特征

近年來開發(fā)上市了多種清開靈口服制劑，其中，膠囊劑包括有普通的硬膠囊和軟膠囊.本研究以清開靈方中的質(zhì)量控制和藥效指標(biāo)成分黃芩苷為對象，首次測定了灌胃給予清開靈膠囊和軟膠囊的大鼠血漿藥物濃度經(jīng)時變化，并分析了二者的藥動學(xué)差異.結(jié)果顯示，從藥時曲線和主要藥動學(xué)學(xué)參數(shù)可知，黃芩苷在SD大鼠內(nèi)的藥動學(xué)行為符合二室開放模型.在相同的黃芩苷給藥劑量下(60 mg/kg)，軟膠囊組大鼠血漿的峰值藥物濃度(Cmax)、藥-時曲線下面積(AUC)以及平均駐留時間(MRT)均明顯高于膠囊組，而達(dá)峰時間(tmax)低于膠囊組，且各參數(shù)的組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).這一結(jié)果表明，清開靈軟膠囊在主要藥效成分黃芩苷上具有明顯優(yōu)于普通硬膠囊制劑的藥動學(xué)特征.軟膠囊與硬膠囊相比，制備工藝先進(jìn)，為棕褐色粘稠狀混懸油狀液(脂溶性物)，體現(xiàn)為吸收更快，吸收程度更高，體內(nèi)駐留時間更長，在臨床應(yīng)用時可能起效更快，藥效更強(qiáng)且更為持久，因而可能是一種更具治療優(yōu)勢的清開靈口服制劑.

清開靈是一種多組分中藥復(fù)方制劑，方中膽酸豬、去氧膽酸清熱鎮(zhèn)驚開竅，水牛角、珍珠母解熱鎮(zhèn)靜安神，金銀花、梔子、板藍(lán)根、黃芩清熱解毒除煩，諸藥相加，共奏良效.按照君臣佐使的中藥組方理論，膽酸、異去氧膽酸等膽汁酸成分為方中君藥，也是除黃芩苷外的主要藥效成分［17］.因此，對于清開靈軟膠囊的藥動學(xué)及潛在的治療優(yōu)勢，后續(xù)尚有必要就膽汁酸、梔子苷等其他藥效成分開展進(jìn)一步的驗(yàn)證研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行人體藥動學(xué)的比較研究，以期為清開靈口服新制劑的臨床合理應(yīng)用提供切實(shí)可靠的科學(xué)依據(jù).

［1］鄧玲玲，田莉，王洪才.安宮牛黃丸及其演化方劑的臨床研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(12): 215-219.

［2］徐孝麟.清開靈制劑的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2(28):101-102.

［3］張桂芝，陳豪君.清開靈在中醫(yī)內(nèi)科急癥的臨床應(yīng)用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1994，10(2):153-154.

［4］國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評價中心.警惕清開靈注射劑嚴(yán)重不良反應(yīng)［J］.中國執(zhí)業(yè)藥師，2009，6(5):22-23.

［5］王芬.清開靈注射液在臨床應(yīng)用中的不良反應(yīng)［J］.中國藥物警戒，2011，8(8):495-497.

［6］鐘月平.不同劑型的清開靈藥物研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(19):192-194.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［8］肖蘭，王峰，李煥德，等.清開靈注射液中黃芩苷在大鼠體內(nèi)代謝動力學(xué)的研究［J］.中國中藥雜志，2007，32 (23):2534-2538.

［9］張妙媛，姚金成，趙緒元，等.清開靈不同制劑的高效液相指紋特征比較［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(2): 442-444.

［10］李玲玲，趙蘭芬.清開靈不同制劑中黃芩苷的含量測定［J］.藥物分析雜志，2011，31(5):950-953.

［11］邢杰.黃芩苷在動物體內(nèi)的吸收和代謝研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學(xué)，2005.

［12］楊新建，王雷，王學(xué)艷.黃芩苷滴丸的體內(nèi)藥動學(xué)研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(4):445-447.

［13］郭慧娟，任淑萌，李艷榮，等.功勞去火片中黃芩苷和小檗堿在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24(1):56-58.

［14］黃萍，高靜雯，鄒佳麗，等.大黃黃連瀉心湯不同配伍下黃芩苷和漢黃芩苷在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)比較研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(2):1445-1450.

［15］于波濤，張志榮，劉文勝，等.黃芩苷穩(wěn)定性研究［J］.中草藥，2002，33(3):218-220.

［16］鞠解奇.清開靈片中黃芩苷體內(nèi)藥代動力學(xué)研究［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2011，33(12):1104-1107.

［17］張加余，張倩，張紅霞，等.清開靈注射液中14種膽汁酸的HPLC-ESI-MS/MS快速鑒定［J］.中國中藥雜志，2013，38(7):990-994.

Pharmacokinetics of Baicalin from Qingkailing Hard Capsules and Soft Capsules in Rats

ZHANG Jing-yue，JIANG Yun-xia，LIU Hui，CHEN Qiu-yu，GAI Cong-hao，XU Hui
(School of Pharmacy，Yantai University，Shandong，Yantai 264005，China)

The pharmacokinetic properties of baicalin from Qingkailing soft capsules and hard capsules in rats are investigated.Healthy male SD rats are randomly divided into two groups(n=6).Through intragastric administration，the animals receive a single oral dose of Qingkailing soft and hard capsules，respectively(both equivalent to 60 mg·kg-1baicalin).Plasma samples are collected at different time points and the concentrations of baicalin in plasma are determined using HPLC method.Pharmacokinetic parameters are calculated according to the plasma concentration versus time profiles，and then the difference in these parameters between groups is statistically analyzed using student’s t-test.The results show that the HPLC assay has a linear range of 0.05 to 10 μg·mL-1baicalin in rat plasma，suggesting satisfied precision and accuracy for the quantification of baicalin in rat plasma.At the same dosage，the main pharmacokinetic parameters of baicalin are Tmax1.5±0.2 h and 2.0±0.3 h，Cmax1.72±0.24 μg/mL and 1.10±0.16 μg/mL，AUC 11.76±1.53(mg/L)·h and 7.58±0.89(mg/L)· h，and MRT 7.25±0.88 h and 5.10±0.69 h for the rats administered Qingkailing soft capsule and hard capsules，respectively.There are statistically significant differences in all these parameters between the two groups(P＜0.05).Compared with Qingkailing hard capsules，Qingkailing soft capsules distribute obvious pahramcokinetic advantages of baicalin in rats，thus may be more appropriate for therapeutic use.

Qingkailing preparation;capsule;baicalin;pharmacokinetics;high-performace liquid chromatography (HPLC)

R285.5

A

(責(zé)任編輯 周雪瑩)

1004-8820(2015)02-0103-05

10.13951/j.cnki.37-1213/n.2015.02.005

2014-08-23

煙臺大學(xué)學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(131406).

張靖悅(1990-)，女，吉林松源人，碩士研究生.

許卉(xuhui33@sina.com)，教授，博士，研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝研究.