清毒片體外抗H1N1亞型流感病毒的研究

王學(xué)文，李永清，章振華，陳小玲，鄭振輝，康愛(ài)君，趙德明

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；3.北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，北京 100107；4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部，北京 100191）

流感病毒（Influenza virus，IV）屬于正黏病毒科成員，為單分子負(fù)鏈RNA病毒，主要分為甲、乙、丙3型。H1N1亞型流感病毒主要侵害人和動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)。它引起的癥狀及并發(fā)癥嚴(yán)重，且病死率比較高。目前，用于治療甲型流感的西藥合成藥物金剛烷胺、達(dá)菲等雖有抑制病毒作用，但其毒副作用大，妨礙其廣泛應(yīng)用，且在發(fā)達(dá)國(guó)家還出現(xiàn)了達(dá)菲耐藥現(xiàn)象［1］。中藥抗H1N1亞型流感病毒研究和應(yīng)用已引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注［2-3］，證實(shí)中藥作用靶點(diǎn)多，既可直接殺滅病毒作用，又有抑制病毒復(fù)制作用，不良反應(yīng)少，藥源豐富，價(jià)格低廉且重視病毒、機(jī)體和中藥三者辯證施治關(guān)系。近年來(lái)中草藥抗病毒研究已成為當(dāng)今醫(yī)藥開(kāi)發(fā)關(guān)注的熱點(diǎn)。清毒片是由多種中藥成分組成的復(fù)方中藥，該中藥針對(duì)解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗感染和調(diào)節(jié)免疫功能而組方。為驗(yàn)證其是否具有抗H1N1亞型流感病毒的功效，本試驗(yàn)對(duì)清毒片體外抗H1N1亞型流感病毒的作用進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 清毒片，是由北京洪天力藥業(yè)有限公司提供的棕色藥片（批號(hào)：20130303）；鹽酸金剛烷胺、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 流感病毒 A／Guangdong／sz223／1997（H1N1）由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽生物制劑高技術(shù)研究室冷凍保存；犬腎上皮細(xì)胞（MDCK）由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽生物制劑高技術(shù)研究室提供，2d～3d傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制

1.2.1.1 清毒片配制 用分析天平稱(chēng)取1g清毒片于100mL燒杯中，然后在燒杯中加入20mL 100℃去離子水，迅速攪拌均勻后，再加入80mL熱水，繼續(xù)攪拌至充分溶解，冷卻過(guò)濾除菌，即得到濃度為10 000μg／mL的清毒片溶液，作為母液4℃保存，用時(shí)稀釋至所需濃度。

1.2.1.2 金剛烷胺配制 用分析天平稱(chēng)取0.1g金剛烷胺于100mL燒杯，加入80mL去離子水，混勻溶解，然后過(guò)濾除菌，即得到1 250μg／mL金剛烷胺無(wú)菌溶液，然后再稀釋至所需濃度即可，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 MTT法測(cè)定清毒片對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度（TC50） 將MDCK細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104個(gè)／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。吸去上清，分別加入10 000、5 000、2 500、1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.06μg／mL清毒片溶液，每濃度4孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照（細(xì)胞＋培養(yǎng)基）。設(shè)金剛烷胺為陽(yáng)性對(duì)照藥，濃度梯度為312.5、156.25、78.125、39.06μg／mL，每濃度4孔，觀(guān)察96h后結(jié)束試驗(yàn)，加MTT染色4h，吸去上清加DMSO溶解0.5h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 570nm值，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算藥物的TC50。

1.2.3 細(xì)胞病變（CPE）法測(cè)定病毒對(duì) MDCK細(xì)胞的半數(shù)感染量（TCID50） 原病毒液在雞胚尿囊腔中培養(yǎng)傳代3次后，測(cè)定血凝滴度為1∶128。MDCK細(xì)胞上適應(yīng)傳代并觀(guān)察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)明顯病變且穩(wěn)定3代后，同時(shí)測(cè)定TCID50。將MDCK細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104個(gè)／孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層，將病毒液用培養(yǎng)液依次10倍稀釋10-3～10-12共10個(gè)濃度加至前10排細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度8孔，最后兩排作為細(xì)胞對(duì)照孔，只加入細(xì)胞維持液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞病變。記錄細(xì)胞病變程度，連續(xù)觀(guān)察96h后結(jié)束試驗(yàn)。用Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.4 清毒片抗 H1N1作用

1.2.4.1 清毒片抑制 H1N1生物合成作用 將MDCK細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104個(gè)／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。加入100μL（100TCID50）病毒，吸附2h后，棄去上清液，隨后再分別加入1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL清毒片溶液，每孔100μL，每濃度4孔。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照（細(xì)胞＋病毒＋培養(yǎng)液）、細(xì)胞對(duì)照（細(xì)胞＋培養(yǎng)液）、清毒片對(duì)照（1 250μg／mL的清毒片溶液＋細(xì)胞＋培養(yǎng)液），另設(shè)金剛烷胺為陽(yáng)性對(duì)照藥，濃度梯度為312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL，每濃度 4孔。逐日觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)病毒對(duì)照孔細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，記錄細(xì)胞病變結(jié)果，連續(xù)觀(guān)察96h后結(jié)束試驗(yàn)，MTT染色法測(cè)定細(xì)胞活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸

1.2.4.2 清毒片抗 H1N1的吸附傳入作用 將MDCK細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104個(gè)／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。拋去上清液，分別加入1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL清毒片，每孔100μL，每濃度4孔。與細(xì)胞預(yù)作用6h后，棄去上清液，再加入含100TCID50的病毒液100μL，吸附2h后，棄去病毒液，PBS洗滌2次，加入含20mL／L FBS的細(xì)胞維持液，每孔100μL。試驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥組和病毒對(duì)照組。逐日觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄細(xì)胞病變結(jié)果，連續(xù)觀(guān)察96h后終止試驗(yàn)，MTT染色法測(cè)定細(xì)胞活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算藥物EC50。計(jì)算TI＝TC50／EC50，用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)流感病毒的吸附傳入作用。

1.2.4.3 清毒片直接滅活H1N1作用 將 MDCK細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104個(gè)／孔，37、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。棄上清液，將不同濃度的藥物的2倍濃度與等體積的200TCID50流感病毒在無(wú)菌EP管中混勻，4℃作用6h后再將混合液接種于細(xì)胞板。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、陽(yáng)性藥及病毒對(duì)照。吸附2h后，拋上清液，加入細(xì)胞維持液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄細(xì)胞病變結(jié)果，連續(xù)觀(guān)察96h后結(jié)束試驗(yàn)，MTT染色法測(cè)定細(xì)胞活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算藥物EC50。計(jì)算TI＝TC50／EC50，用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)流感病毒的吸附傳入作用。分析，計(jì)算藥物EC50。采用治療指數(shù)（treatment index，TI）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)流感病毒的生物合成作用，TI＝TC50／EC50。

2 結(jié)果

2.1 HIN1對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50

細(xì)胞感染病毒后出現(xiàn)明顯病變，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞之間拉網(wǎng)、皺縮、呈星狀聚集成團(tuán)、脫落（圖1），而對(duì)照孔中的MDCK細(xì)胞狀如梭形或者多邊形，H1N1的 TCID50為10-4.12／100μL。

圖1 MDCK細(xì)胞感染病毒后形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphological changes of virus-infected MDCK cells

2.2 清毒片對(duì)MDCK細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（TC50）的測(cè)定

中藥清毒片的不同濃度對(duì)細(xì)胞的毒性結(jié)果，見(jiàn)表1。光鏡下觀(guān)察，清毒片對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為：細(xì)胞增殖緩慢，折光性發(fā)生改變，腫脹變圓，部分細(xì)胞貼壁能力下降，破碎，脫落，胞漿內(nèi)顆粒增多（圖2）。

由表1可知，清毒片的TC50≥2 500μg／mL，其細(xì)胞存活率很低，清毒片的TC50≤1 250μg／mL，細(xì)胞存活率≥75%，金剛烷胺藥物濃度為312.5μg／mL時(shí)，細(xì)胞存活率≥80%，金剛烷胺最大無(wú)毒濃度大于312.5μg／mL。SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度TC50為1 596μg／mL。由圖2可見(jiàn)，加入1 250μg／mL清毒片組96h后和對(duì)照組細(xì)胞無(wú)差異（圖2A，圖2B）；而加入2 500μg／mL清毒片組96h后細(xì)胞脫落，皺縮成團(tuán)（圖2C）。

表1 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性結(jié)果表Table 1 Toxicity of drug to MDCK cells（±SD）

表1 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性結(jié)果表Table 1 Toxicity of drug to MDCK cells（±SD）

藥物Drugs藥物濃度／（μg·mL-1）Drug concentration吸光度值A(chǔ)bsorbance value細(xì)胞存活率／%Cell survival rate 10 000 0.24±0.03 20 5 000 0.139±0.01 12 2 500 0.197±0.03 17 1 250 0.89±0.02 75清毒片Qingdupian 625 0.93±0.11 79 312.50 0.94±0.01 80 156.25 1.11±0.14 95 78.12 1.18±0.11 100 39.06 1.18±0.14 100 312.50 0.97±0.03 82 156.25 0.96±0.05 81金剛烷胺Amantadine 78.12 1.05±0.02 89 39.06 1.20±0.04 100

圖2 清毒片對(duì)MDCK細(xì)胞毒性作用Fig.2 Toxicity of Qingdupian to MDCKcells

2.3 清毒片抗H1N1作用結(jié)果

2.3.1 清毒片抑制H1N1在細(xì)胞內(nèi)合成的測(cè)定結(jié)果 給藥48h后，觀(guān)察到到病毒對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的CPE（圖1A）。各濃度試驗(yàn)孔細(xì)胞與病毒對(duì)照孔有明顯區(qū)別，試驗(yàn)孔細(xì)胞明顯多于病毒對(duì)照孔，MTT法測(cè)定清毒片對(duì)H1N1抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出在藥物的安全范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，清毒片抗H1N1的抑制率而增強(qiáng)，呈一定的量效關(guān)系，其治療指數(shù)為3.5。

表2 清毒片抑制H1N1細(xì)胞內(nèi)合成作用Table 2 Inhabition H1N1intracellular biosynthesis effect of Qingdupian ±SD

表2 清毒片抑制H1N1細(xì)胞內(nèi)合成作用Table 2 Inhabition H1N1intracellular biosynthesis effect of Qingdupian ±SD

藥物濃度／（μg·mL-1）Drug concentration 73 625 0.89±0.07 0.82±0.02 0.69±0.05 69 65 63 312.5 0.76±0.06 0.68±0.06 0.58±0.04 58 53 51 411 434 532 3.5 156.25 0.58±0.02 0.60±0.04 0.50±0.04 43 46 44 78.12 0.45±0.04 0.48±0.06 0.42±0.03 32 35 36 39.06 0.30±0.05 0.38±0.02 0.39±0.01 18 27 eutic index 1 250 1.09±0.15 0.94±0.09 0.79±0.09 86 76 OD值OD value病毒抑制率／%Virus inhibitory rate半數(shù)有效濃度／（μg·mL-1）Median effective concentration治療指數(shù)Therap 33

2.3.2 清毒片抗H1N1的吸附傳入作用的測(cè)定結(jié)果 給藥48h后觀(guān)察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)病毒對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的CPE，各濃度試驗(yàn)孔細(xì)胞明顯多于病毒對(duì)照孔，MTT法測(cè)定清毒片對(duì)H1N1抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，清毒片抗H1N1的抑制率隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，且呈一定的量效關(guān)系，其治療指數(shù)為3.6。

表3 清毒片抑制H1N1吸附、傳入細(xì)胞作用Table 3 Anti-influenza H1N1adsorption and accession to cells of Qingdupian ±SD

表3 清毒片抑制H1N1吸附、傳入細(xì)胞作用Table 3 Anti-influenza H1N1adsorption and accession to cells of Qingdupian ±SD

藥物濃度／（μg·mL-1）Drug concentration病毒抑制率／%73 625 0.78±0.06 0.72±0.03 0.75±0.08 67 68 68 312.5 0.65±0.06 0.63±0.02 0.62±0.03 55 58 53 404 458 467 3.6 156.25 0.53±0.02 0.45±0.04 0.48±0.04 43 39 39 78.12 0.41±0.04 0.42±0.03 0.38±0.07 32 36 31 39.06 0.33±0.03 0.34±0.15 0.34±0.06 25 28 eutic index 1 250 0.95±0.08 0.91±0.04 0.85±0.03 84 88 OD值OD value Virus inhibitory rate 半數(shù)有效濃度／（μg·mL-1）Median effective concentration治療指數(shù)Therap 26

2.3.3 清毒片直接滅活H1N1的測(cè)定結(jié)果 該試驗(yàn)方法是相應(yīng)濃度的清毒片和病毒在體外作用6h，然后加入96孔細(xì)胞板。48h后發(fā)現(xiàn)病毒對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的CPE，各濃度試驗(yàn)孔細(xì)胞明顯多于病毒對(duì)照孔，MTT法測(cè)定清毒片對(duì)H1N1抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，清毒片抗H1N1的抑制率隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，且呈一定的量效關(guān)系，其治療指數(shù)為3.4。

表4 清毒片直接滅活H1N1亞型流感病毒作用Table 4 Killing influenza H1N1effect of Qingdupian ±SD

表4 清毒片直接滅活H1N1亞型流感病毒作用Table 4 Killing influenza H1N1effect of Qingdupian ±SD

藥物濃度／（μg·mL-1）Drug concentration 75 625 0.75±0.03 0.80±0.10 0.82±0.03 62 65 64 312.5 0.62±0.10 0.64±0.04 0.68±0.06 51 51 52 479 481 461 3.4 156.25 0.57±0.06 0.58±0.05 0.55±0.02 46 46 41 78.12 0.40±0.06 0.41±0.04 0.50±0.06 32 31 37 39.06 0.37±0.04 0.38±0.04 0.37±0.05 29 28 eutic index 1 250 0.87±0.04 0.96±0.05 0.95±0.01 72 78 OD OD value病毒抑制率／%Virus inhibitory rate半數(shù)有效濃度／（μg·mL-1）Median effective concentration治療指數(shù)Therap 26

3 討論

本試驗(yàn)選用H1N1株，結(jié)合CPE和MTT法，分析了復(fù)方中藥清毒片體外抗流感作用。

試驗(yàn)選用的清毒片是由蒲公英、百部等多味中藥制成的復(fù)方中藥片劑，該中藥經(jīng)提取、濃縮等現(xiàn)代工藝提取出咖啡酸、葛根素和苜蓿素等多種成分。咖啡酸具有抗氧化、抗病毒、抗炎和抗菌等作用［4-5］。葛根素具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抑制肺癌和抗炎作用［6-8］。苜蓿素是豆科植物紫苜蓿的濃縮提取物，研究證實(shí)苜蓿素有清熱解毒功效，且有抗氧化、抗菌和增強(qiáng)免疫力等多種生物活性［9］。蒲公英局具有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋之功效，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)蒲公英還具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒作用［10-12］。百部味甘、苦，微溫，歸肺經(jīng)，具有良好的止咳、化痰、平喘和抗炎功效［13］。從組方和提取成分可以看出，清毒片具有抗病毒，增強(qiáng)免疫力作用，而且可以抗病毒感染帶來(lái)的炎癥，緩解高熱和調(diào)節(jié)肺循環(huán)等功能。

從試驗(yàn)方法而言，CPE帶有一定的主觀(guān)性，而MTT法簡(jiǎn)單直觀(guān)，二者相結(jié)合可定量評(píng)估藥物抗病毒的活性［14］，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在清毒片安全濃度范圍內(nèi)（TC50＜1 596μg／mL），抑制作用和藥物濃度表現(xiàn)出一定量效關(guān)系，清毒片抑制H1N1的能力隨藥物濃度的增大而增強(qiáng)。本文采用了治療指數(shù)作為對(duì)病毒抑制效力的評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果顯示先感染病毒后給藥，先給藥后感染病毒和藥物病毒同時(shí)作用3種藥物與病毒的作用方式的TI分別為3.5、3.6和3.4，TI都大于常規(guī)藥物的2.0［15］，說(shuō)明該藥物是低毒高效的，也充分說(shuō)明清毒片具有明顯的抑制H1N1在MDCK細(xì)胞內(nèi)的生物合成作用，阻止H1N1的吸附細(xì)胞的作用和直接滅活作用。說(shuō)明清毒片具有多環(huán)節(jié)抗H1N1流感病毒作用，但其作用機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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