骨縫牽引成骨動物模型的建立及應用

李東 黃曉翔 Sean Shih-Yao Liu 徐海淞 曹德君 柴崗 韋敏

縫牽引成骨是從口腔正畸技術發(fā)展起來的，近年來逐漸應用于顱頜面外科[1-3]，為面部骨骼發(fā)育不全的治療提供了新的選擇。骨縫牽引成骨是指應用外力作用于生長中的骨縫，誘導骨縫及其周邊骨骼改建，使新骨形成、骨骼位置改變的生物過程。目前有關縫牽引成骨技術的一些基礎理論和臨床治療問題還有待不斷研究和探討，骨縫牽引成骨較長的療程以及新骨生成、礦化不良所引起的各種并發(fā)癥是影響該技術在臨床推廣應用的主要障礙。

為了進一步研究骨縫牽引成骨的機制及促進骨縫牽引成骨效率的方法，我們希望能建立一種既能簡單有效地牽開骨縫，又可調節(jié)牽引力及牽引方式，且有較高成功率的骨縫牽引動物模型。鎳鈦合金彈簧能提供均勻持久的彈性牽引力[4]，結合新型的即刻牽引微型牽引種植釘（Miniscrew implants，MSI）作為支抗[5-6]，或許能有效牽開骨縫且能控制和調節(jié)牽引力；而新西蘭白兔的顱骨矢狀縫常被作為顱骨縫實驗的首選。

本實驗目的是建立兔顱骨矢狀縫牽引成骨的動物模型，并驗證該模型的可操作性及可靠性，探索局部應用rhBMP-2對牽引成骨的作用，為后續(xù)顱縫牽引成骨的相關機制研究提供良好的動物模型。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔14只，11周齡，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 牽引器

自行設計，50 g鎳鈦合金牽開彈簧（Sentalloy GAC，Bohemia，美國），微型牽引種植釘支抗（Daegu，韓國）， 直徑 0.7 mm鈦絲 （99.9%鈦，A Johnson Matthey Company，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物及分組

將14只兔隨機分為實驗組（牽引+rhBMP-2，n=7）和對照組（單純牽引，n=7）。兩組分別以50 g力鎳鈦合金彈簧持續(xù)等張牽引29 d；實驗組動物在顱骨矢狀縫局部應用rhBMP-2。

1.3.2 牽引模型的建立及基本操作

以氯胺酮75 mg/Kg肌肉注射麻醉動物，手術區(qū)域備皮，無菌操作。以MSI作支抗植入顱骨固定（圖1A），并分離骨膜，將可吸收海綿（Absorbable collagen sponge，ACS）剪成 6 mm×8 mm×2 mm 大小，浸于濃度為0.1 mg/mL的rhBMP-2溶液中，隨后將浸有rhBMP-2的可吸收海綿置于實驗組骨膜下 （圖1C）。兩MSI之間置入50 g力鎳鈦合金牽開彈簧（圖1D、E）。在MSI前方3~4 mm處，分別釘入2個鈦釘（圖1F）作為骨影像學標記。對照組動物僅行牽引操作，骨膜下未放置rhBMP-2（圖1B）。通過記錄各階段X線片上金屬物影像變化，比較骨縫牽開距離及牽引種植釘偏移情況。在手術當天（0 d）及術后第5、11、17、23及29 d記錄和調節(jié)牽引力，并使彈簧始終保持在有效牽引力范圍。

1.3.3 數據采集和記錄

第 0、5、11、17、23 及 29 d 記錄動物體質量，拍攝X線平片及Micro-CT。第7、27天注射四環(huán)素（13.6 mg/lb/im），第 17 天注射鈣黃綠素（10 mg/Kg/im）。前期研究表明，熒光骨標記過的動物在牽引成骨后，新生骨結合有熒光骨標記，因此可以通過熒光顯微鏡觀察不同時期矢狀縫間骨骼的改建情況。

1.3.4 組織標本的制備

牽引第29天，取有效標本區(qū)，包括：矢狀縫，臨近的顱骨，微型牽引種植釘及鈦骨標記區(qū)域。并立即用70%乙醇固定7 d。標本以甲基丙烯酸甲酯固定后制作成約60 μm的顱縫冠狀面切片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 數據的測量與分析

使用Viewbox 3.1軟件，由單人隨機測量全部X線平片，包括微型牽引種植釘間距MSIr及鈦骨標間距MSIm，每張照片測量3次取均值。通過X線平片測量MSIr、MSIm結果，以評估顱縫牽開情況及牽引種植釘位移情況。

組織切片用Nikon 80i熒光顯微鏡觀察四環(huán)素標記（綠色）及鈣黃綠素標記（紅色），并用Photometrics Coolsnap K4高清攝像頭及MetaMorph 6.3軟件捕捉影像。

1.3.6 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗動物體重、骨縫牽開距離的比較分別采用t檢驗及方差分析，所得數據以s表示，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

實驗前后動物平均增重1 093~1 218 g，各組間體重增加差異無統計學意義（P>0.05），說明牽引治療對兔生長無明顯影響，實驗兔耐受治療。對照組有2只動物出現MSI脫落，這些動物測量的數據統計截止至MSI脫落前一天。而實驗組未見牽引釘脫落。本次實驗MSI牽引系統成功率為86%（12/14）。

2.2 X線平片及Micro-CT

牽引結束后行頭顱X線平片測量，并對動物頭顱進行Micro-CT掃描以評價牽引效果。

X線平片測量鈦骨標記間距變化顯示，牽引周期 29 d 后，對照組顱縫平均牽開（1.28±0.13）mm，實驗組平均牽開（1.04±0.12）mm，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）（圖 2A、圖 4A）。

X線平片測量牽引種植釘間距MSIr變化顯示，實驗后對照組平均牽開（2.35±0.17）mm，實驗組平均牽開（1.87±0.12）mm，差異有統計學意義（P<0.05）（圖 2B、圖 4B）。

相同牽引力及牽引時間，實驗組牽引后顱縫間隙較小，說明牽引過程中伴隨有新骨的形成。Micro-CT圖示可明確顯示牽引情況（圖3）。

2.3 組織學觀察

實驗組各熒光免疫標記線重疊或間隔狹小 （圖5A），說明在牽引過程中伴隨著較多的快速成骨。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現，單純牽引組各時間點熒光標記線清晰（圖5B），說明第7～17天及第 17～27天均有一定量的新骨沿骨縫邊緣向骨縫間隙生長。

圖1 兔矢狀縫牽引模型Fig.1 The rabbit model of sagittal suture traction

圖2 牽引結束后頭影X線片Fig.2 X-ray after ditraction

圖3 Micro-CT顯示牽引效果Fig.3 The effect of distraction

圖5 矢狀縫冠切面熒光標記影像Fig.5 Fluorescent labeled sections of sagittal suture

3 討論

上世紀60年代以來，隨著上頜骨前移或后退牽引矯正牙頜面畸形的興起，相繼報道了腭中縫、上頜骨周圍骨縫及顱骨矢狀縫對張力作用的反應[7-10]。1997年，Carls等[11-12]報道了通過骨縫牽引成骨延長了6只成年狗的硬腭，驗證了顱面部骨縫牽引成骨的可行性；1999年，Tung等[13]通過牽引兔顱縫成骨實驗，驗證了縫牽引成骨的可行性。柳春明等[14]在狗模型上，經手術形成硬腭的裂隙，用鎳鈦記憶合金縫牽引器牽張腭骨外側縫，使裂隙兩側腭骨向中線移動關閉裂隙成功，說明縫牽引技術可以誘導犬腭骨外側縫的骨再生，修復硬腭的缺損。以上動物模型雖然能進行縫牽引成骨的相關研究，但是狗、羊等大型動物模型不易大量飼養(yǎng)，牽引器的設計及制造也相對復雜，實驗成本較高，缺乏大樣本實驗的可行性。

本實驗中，我們成功創(chuàng)建了以微型牽引種植釘MSI為支抗的兔顱骨矢狀縫牽引系統。經驗證，該顱縫牽引模型操作簡單，牽引方式可控，經濟實用。本實驗所有牽引裝置均耐受治療全過程，無銹蝕、彎曲及斷裂現象。在器械外露端，皮膚與器械緊密貼合，封閉性良好，軟組織均一期愈合，未見感染發(fā)生。本實驗中所用的11周齡新西蘭白兔為青壯年期[15]，可見只要骨縫未閉合，仍可通過牽引應力對骨縫進行改建，達到矯正顱面部骨骼畸形的目的。

本實驗中，我們應用了微型牽引種植釘MSI作為即刻牽引支抗，雖然螺紋長度只有3 mm，但是成功率達到了86%，和以往文獻報道的術后種植釘即刻牽引成功率接近[16-18]。文獻報道顯示，大多的種植釘牽引失敗多在前1~2周[19-22]，這可能是由于首次種植后，種植釘與顱骨結合穩(wěn)定度不夠造成的。我們總結了各牽引釘脫落的可能原因，認為第一對微型牽引種植釘脫落可能是因操作不當及螺釘磨損導致，種植釘螺紋的損傷極易導致種植牽引的失敗[22]；另一對微型牽引種植釘在第18天脫落，未見明顯感染跡象，可能是由于種植后牽引種植釘周圍骨質愈合不好加上牽引中輕微的移動，導致脫落。而實驗組則未見牽引種植釘的脫落，考慮主要與其在牽引過程中的快速成骨有關。本實驗中3 mm微型牽引種植釘較常用的種植牽引支抗要短，我們較高的成功率說明，對于種植釘的穩(wěn)定性，其直徑的大小較之長度更為重要[23]。

研究發(fā)現，機械應力刺激作用于顱面部骨縫，影響其中的成骨細胞的增殖分化和基質合成，使骨縫的寬度增加，骨縫邊緣新骨沉積[24-25]。在外牽引力的作用下，骨縫的組織與形態(tài)發(fā)生明顯的變化：骨縫變寬；骨縫組織中的細胞發(fā)生分化、增殖，新骨不斷形成。骨縫組織為適應外牽引力而發(fā)生了一系列的骨縫組織結構的改建，從而形成了新的骨縫組織形態(tài)。本實驗中，牽引后對照組骨縫標本頭影平片及Micro-CT精細三維重建均可見矢狀縫牽開距離較大，可見明顯骨縫間隙，有一定量的新骨沿應力方向排列。說明牽引成骨模型成功建立，并且牽引過程中伴隨新骨形成。

BMP參與骨骼的生長、發(fā)育及創(chuàng)傷修復，rhBMP-2的臨床應用基于其生物學活性。Wang等[26]最早發(fā)現利用大鼠的脫鈣骨基質作為載體，rhBMP-2可以誘導骨形成。研究顯示，rhBMP-2誘導新骨形成的同時，可與原來存在的骨成功結合，這顯示了rhBMP-2臨床應用的可能性。近年來，相關研究關注于BMP在牽張成骨過程中的作用[27-28]。為了探討rhBMP-2是否能加速牽引成骨，本實驗我們在單純牽引的基礎上，局部應用rhBMP2進一步觀察其對顱縫的改建作用。

通過測量牽引種植釘及鈦骨標在牽引前后的位移，我們發(fā)現實驗組骨縫在0~5 d牽開趨勢與對照組相似，但5~29 d骨縫牽開率較對照組明顯下降。各組骨縫牽開數據經方差分析顯示，對照組與實驗組矢狀縫牽開距離之差異有統計學意義 （P<0.05）。我們認為，在牽引早期由于周圍組織的彈性阻力及成骨量較少，所以牽引距離增加較快；而在5 d后，周圍組織的彈性阻力及臨近骨組織的阻力作用開始顯現，所以牽引距離的增加速度開始下降，尤其是實驗組，局部應用rhBMP-2導致局部快速成骨，使得牽引阻力進一步增加，最終導致其牽開距離明顯小于對照組。經組織學切片觀察骨縫冠切面顯示，對照組骨縫間隙明顯，各時間段熒光標記線清晰顯示，說明在各時間段均有一定量的新骨生成，但新骨生成量不及牽開的速度。而在實驗組，熒光標記線多數重疊或狹窄，骨縫可見有較多的骨質形成。說明在牽引過程中，伴有快速成骨，局部應用rhBMP-2能明顯促進牽引成骨的速度。因此，局部應用適當濃度的rhBMP-2可提高縫牽引成骨效率，縮短牽引治療周期，并有可能減少術后復發(fā)。

兩組牽引結束后，MSI的牽開距離稍大于鈦骨標之間的距離，但差別均小于2 mm，我們認為這種距離差異主要與周圍軟組織的彈性阻力，以及鄰近骨組織的阻力有關。這說明，在牽引阻力明顯增加后，MSI在牽引力作用下相對骨面產生了微小位移。文獻報道指出，即刻種植牽引可使種植釘偏移達2 mm以上[29]，本實驗持續(xù)牽引位移在可接受范圍內。

4 總結

本實驗采用自行研制的微型種植釘彈力牽引系統，成功地建立了兔矢狀縫彈力牽引成骨模型，該模型證實矢狀縫牽引成骨效果可靠，具有可行性、可靠性、可重復性、價格便宜、成功率較高的特點。在骨縫牽引過程中，局部應用rhBMP-2可提高縫牽引成骨效率，縮短牽引治療周期，減少術后復發(fā)。

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