可梯度降解支架細胞化后修復兔前交叉韌帶缺損

張文元 楊亞冬 張科技 唐 靚 房國堅

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可梯度降解支架細胞化后修復兔前交叉韌帶缺損

張文元 楊亞冬 張科技 唐 靚 房國堅

目的 通過可梯度降解的繩-網(wǎng)支架復合自體骨髓間充質干細胞(MSCs)，修復兔前交叉韌帶(ACL)缺損。方法將聚乳酸∶蠶絲絲素∶聚羥基乙酸纖維按質量比7∶6∶5混合，分別捻擰成繩芯與緯編針織成網(wǎng)狀物，滴加Ⅰ型膠原并凍干。將網(wǎng)狀物包裹繩芯，種植兔自體MSCs，植入兔前交叉韌帶(ACL)缺損處，作為實驗組。單純支架置入為對照組。分別于術后12、24周，取材，HE染色，并行力學測試。結果 術后12周，實驗組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生大量有序的垂直膠原纖維；對照組形成少量垂直膠原纖維。術后24周，實驗組形成類似直接止點結構；對照組則產(chǎn)生許多垂直膠原纖維。力學測試結果顯示，術后12、24周實驗組的最大載荷分別為72.7±23.4N與121.8±34.3N，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 可梯度降解支架復合自體MSCs能較好地重建兔ACL。

前交叉韌帶 修復 骨髓間充質干細胞 梯度降解支架

大部分膝部韌帶損傷發(fā)生在前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)，發(fā)生率一般為1/3000，ACL一旦斷裂無法自愈。目前臨床重建前交叉韌帶使用的材料包括自體移植物、異體移植物和人工合成材料，但都存在無法克服的局限性。其缺陷主要包括：自體移植物來源有限且多有供區(qū)部位并發(fā)癥；異體移植物受來源限制，且有傳播疾病和產(chǎn)生免疫排斥的風險；人工材料重建ACL自20世紀80年代起逐漸得以在臨床使用，然而盡管短期效果令人滿意，但是長期隨訪結果不盡人意，主要原因是材料力學強度和抗摩擦性質都較差，疲勞斷裂發(fā)生率高，還有材料和組織之間的生物相容性較差是阻礙其臨床推廣的主要因素。通過組織細胞培養(yǎng)使支架材料細胞化的組織工程技術為ACL重建提供了新的思路和方法，為再生韌帶組織提供了一條新的途徑[1]。本實驗采用擰捻-針織、繩-網(wǎng)結合制備可梯度降解的蠶絲絲素-PLA-PGA/膠原支架，并以自體骨髓間充質干細胞(MSCs)為種子細胞，構建支架-MSCs復合物。并將支架-MSCs復合物置入兔ACL缺損處，進行ACL修復重建，并檢測重建情況。

材料與方法

1.實驗材料與儀器：蠶絲(Bombyx mori silk)由浙江海寧蠶農贈送。聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)纖維細絲，上海天清生物材料有限公司生產(chǎn)，呈乳白色，均勻柔韌。纖維連接蛋白(Sigma公司)，Ⅰ型鼠尾膠原(杭州生友生物技術有限公司)，抗兔CD14-FITC與抗兔CD44-PE(Antigenix America)。主要實驗儀器：掃描電鏡(XL30-ESEM，荷蘭Philips公司)，微機控制電子萬能試驗機(QX-W300，上海企想檢測儀器有限公司生產(chǎn))，冷凍干燥機(Heto PowerDry LL3000，丹麥生產(chǎn))，流式細胞儀(FACSCalibur,BD,美國生產(chǎn))。實驗動物為新西蘭白兔，由浙江省實驗動物中心提供并飼養(yǎng)，實驗動物質量合格證號：SCXK(浙)2009-0039號。

2.自體兔骨髓間充質干細胞(MSCs)提?。簠⒄瘴墨I[2]提取，純化，培養(yǎng)。從4月齡新西蘭白兔(體重2.0～2.2kg，雌性)髂后上棘穿刺抽取骨髓，通過密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法分離、純化、擴增而獲得MSCs。分離的BMSCs參照文獻[3]進行抗兔CD14-FITC、抗兔CD44-PE的流式細胞儀檢測，細胞表面標記CD14基本為陰性；而CD44呈陽性，表達均在80%以上。被抽取骨髓后的兔子繼續(xù)飼養(yǎng)，將作為制作韌帶缺損動物模型，回植自體MSCs組織工程韌帶實驗之用。

3.蠶絲絲素-PLA-PGA纖維編織支架制備：將蠶絲浸入0.5% Na2CO3溶液中(按1g蠶絲加質量分數(shù)為0.5%的 Na2CO3溶液1000ml比例)煮沸30min，更換Na2CO3溶液，再煮沸30min，去除絲膠。并用95℃去離子水充分沖洗，室溫晾干，得到蠶絲絲素(SF)纖維。按下列順序編織：按PLA、SF、PGA纖維以質量比7∶6∶5均勻混合并平行排列(含蠶絲絲素纖維單絲40根、PLA纖維單絲16根、PGA纖維單絲12根，共含三者單絲68根)，記為(×1)，順時針扭合成1束纖維束，記為(×2)，共含三者單絲136根。再將該纖維束(×2)通過緯編針織成長條狀網(wǎng)狀物(長3.00cm×寬0.65cm)，詳見圖1。另外，將絲素-PLA-PGA纖維束(×2)逆時針扭合、再順時針扭合成繩芯支架(×8，含544根單絲)。將繩、網(wǎng)支架分別經(jīng)0.1mol/L稀鹽酸(HCl)、蒸餾水、0.1mol/L NaOH、蒸餾水超聲清洗機洗滌，以清除在紡絲和編織過程中黏附在纖維表面和空隙內的雜質和污物。5mg/ml濃度的Ⅰ型鼠尾膠原用0.1mol/L NaOH中和后，滴加于繩、網(wǎng)支架上，盡量使其浸透，-60℃冰箱過夜，置于冷凍干燥機凍干。再將網(wǎng)狀物包裹繩芯(圖2)，用3號縫合線編織縫合，縫扎緊，即為繩-網(wǎng)支架，環(huán)氧乙烷消毒備用。

圖1 緯編針織示意圖

圖2 網(wǎng)狀物包裹繩芯的復合支架

4.支架-MSCs復合物制作：采用培養(yǎng)液將纖維連接蛋白配制成200μg/ml溶液。將網(wǎng)-繩支架浸入該蛋白溶液中，4℃靜置24h，常溫晾干。以注射方式將第3代自體MSCs懸液(2×107個細胞/毫升，約0.3ml用量/支架)注入支架，使細胞充分滲入支架孔隙中，并使細胞懸液在支架上達到飽和狀態(tài)，體外培養(yǎng)7天，隔天換液，制作支架-自體MSCs復合物。置入動物前清洗掉殘余培養(yǎng)液。

5.前交叉韌帶(ACL)缺損動物模型制作及支架-MSCs復合物的植入：參照文獻[4]制作ACL缺損動物模型(圖3)。先前已抽過骨髓的新西蘭白兔，3%戊巴比妥鈉1.1ml/kg(即33mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，取雙膝內側髕旁切口暴露關節(jié)，切斷并完全去除正常ACL，沿原ACL走向，用直徑2.7mm鉆頭分別鉆股骨和脛骨骨隧道，將支架-MSCs復合物穿經(jīng)骨隧道，于膝關節(jié)屈曲30°狀況下拉緊移植物，兩端鉆骨橋打結固定，檢查前抽屜及Lachman試驗陰性后，逐層間斷縫合切口?；贾还潭?，單籠飼養(yǎng)。術后每只兔子連續(xù)耳緣靜脈注射青霉素(50萬U/d)3天。實驗組10只(20膝，置入支架-自體MSCs復合物)，MSCs均為自體分離回植；對照組10只(20膝，單純置入支架)。

圖3 ACL手術模型示意圖

6.前交叉韌帶缺損修復重建情況觀察：分別于移植術后12與24周，各隨機處死一半動物。新生ACL連同脛骨及股骨取材，每組于一個時間點取2個標本用于組織學檢測，8個標本用于拉力實驗。(1)新生韌帶-骨愈合的組織學觀察：觀察骨隧道內移植物界面愈合情況。取材新生前交叉韌帶連同脛骨、股骨，脫鈣，沿骨隧道縱向剖開，修整，石蠟包埋，沿骨隧道縱向切片，HE染色。觀察骨隧道和新生韌帶間界面愈合的組織學變化。(2)新生ACL的力學性能檢測：取實驗兔膝關節(jié)，保留股骨遠端和脛骨近端各約3cm，去除膝關節(jié)標本周圍軟組織及縫線，保留新生ACL。將股、脛骨端分別固定于試驗機牽引臺兩端，股骨與脛骨輕度傾斜，拉力經(jīng)過韌帶軸線。試驗過程滴加生理鹽水保持標本濕潤。先行預拉伸3次后，行拔出或拉斷試驗，拉伸速度50mm/min，測試最大抗拉載荷(最大拔出或斷裂載荷)，觀察股骨-移植物-脛骨復合體是斷裂還是被拔出。

結 果

1.MSCs在支架材料上增殖、生長的掃描電鏡觀察情況：復合培養(yǎng)48h，MSCs細胞附于支架生長，增殖良好，細胞大多呈梭形，形態(tài)較佳，呈立體狀生長，并分泌基質(圖4)。

圖4 MSCs在支架上培養(yǎng)48h的掃描電鏡觀察(×500)

2.大體觀察：在大體觀察方面，術后1～3天，動物的飲食、精神、活動稍差，而后狀態(tài)良好，傷口愈合良好，未見感染與死亡。

3.新生韌帶-骨愈合的組織學觀察：術后12周，實驗組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生許多有序的垂直膠原纖維(Sharpey′s fiber) (圖5A)，并有類軟骨細胞出現(xiàn)，形成間接止點，說明已經(jīng)出現(xiàn)軟骨化骨過程。而對照組新生韌帶組織細胞排列較紊亂，罕見形成垂直膠原纖維(圖5B)。術后24周，實驗組從新生韌帶向骨方向形成類似于韌帶-纖維軟骨-鈣化軟骨-骨4個區(qū)域的直接止點結構(圖5C)。而對照組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生許多有序的垂直膠原纖維(圖5D)，形成間接止點。

圖5 術后兩組病理切片(HE染色,×400)A.術后12周實驗組;B.術后12周對照組;C.術后24周實驗組;D.術后24周對照組；圖中箭頭所示為垂直膠原纖維

4.生物力學測試結果：術后12周，實驗組、對照組新生韌帶均從骨隧道拔出(拔出率100%)；實驗組、對照組的最大抗拉載荷分別為72.7±23.4N、39.2±15.5N，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.38，P<0.01)。術后24周，實驗組大多從骨隧道拔出(拔出率75%)，而對照組均拔出(拔出率100%)；實驗組、對照組的最大抗拉載荷分別為121.8±34.3N、67.4±26.2N，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.56，P<0.01)。

討 論

韌帶組織工程對力學性能有特殊的要求，天然蠶絲絲素纖維力學強度高，生物相容性好[5]。將絲素纖維經(jīng)螺旋纏繞成繩索狀后，具有很強的耐疲勞性能[6]。但也存在種子細胞主要附于繩狀支架表面，難以滲入支架內部的問題，阻礙了新生組織長入，有必要加以改進。緯編針織網(wǎng)狀結構具有更高的孔隙率，能為細胞生長與組織向內生長提供更多的空間[7]。本實驗通過擰捻-針織、繩-網(wǎng)結合進行，將網(wǎng)狀物包裹繩芯而成支架，兼顧力學性能與細胞生長。這樣既能保證支架的優(yōu)異的力學性能，又能使種子細胞較好地在支架上生長，利于支架-MSCs復合物的構建。

蠶絲絲素纖維具有緩慢的降解速度，單純以蠶絲絲素纖維制作支架，可能存在不能及時騰出足夠空間而影響組織再生等問題。PGA具有高降解速度及親水性良好，PLA具有高強度，支架整體的降解速率可以通過調節(jié)PLA與PGA的比例而得到較好的控制[8～10]。膠原、PGA先降解，PLA次之，蠶絲最后降解。研究表明蠶絲-PLA-PGA纖維混合繩狀支架的力學性能優(yōu)異，并具有良好的生物相容性[11]。

MSCs具有分化為成骨、軟骨、肌腱及韌帶等細胞的多向分化潛能，理論上有利于移植后形成韌帶-骨愈合的致密結締組織、纖維軟骨、鈣化纖維軟骨、骨的四區(qū)為特征的直接止點[12]。理想的韌帶組織工程種子細胞應具有以下特性：來源廣，數(shù)量充足，增殖能力強，可大量擴增并且具備特定的生物學功能，分泌具有合適構成的細胞外基質。Ge等[13]通過體外細胞培養(yǎng)比較內側副韌帶成纖維細胞、ACL成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、MSCs幾種細胞發(fā)現(xiàn)：MSCs增殖率和分泌膠原總量是最高的，并且3種細胞都表達Ⅰ、Ⅲ型膠原，α-肌動蛋白，都不表達Ⅱ型膠原，表明與其他幾種細胞相比，MSCs可能是較理想的種子細胞。有研究表明，MSCs能促進ACL重建后腱-骨愈合作用，縮短腱骨愈合時間，可形成類似正常的直接止點結構，而非瘢痕連接的間接止點[14,15]。MSCs可分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原、腱糖蛋白C以及一些對韌帶修復有促進作用的細胞因子與組織酶，符合韌帶生物學特征，是韌帶組織工程較理想的種子細胞[16]。

本實驗結果表明，實驗組術后12周可形成間接止點，術后24周可形成類似于直接止點的結構。對照組術后12周，新生韌帶組織細胞排列較紊亂，術后24周可形成間接止點。在力學性能方面：術后12周，實驗組、對照組新生韌帶均從骨隧道拔出；術后24周，實驗組大多從骨隧道拔出，而對照組均拔出。在最大抗拉載荷方面，實驗組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義，但與成年兔正常ACL均有較大差距。因此，支架材料與構建及種子細胞的選擇等問題尚需進一步研究。

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(修回日期：2015-02-13)

Gradient Degraded Scaffold Seeded with Mesenchymal Stem Cells Repairing Anterior Cruciate Ligament in Rabbits.

ZhangWenyuan，YangYadong，ZhangKeji，etal.

InstituteofBioengineering，ZhejiangAcademyofMedicalSciences，Zhejiang310013，China

Objective To use a gradient degraded wire-mesh scaffold compound autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) repairing rabbit anterior cruciate ligament(ACL) defect. Methods After polylactic acid(PLA)∶silk fibroin(SF)∶polylactic acid(PGA) fibers(mass ratio 7∶6∶5) being mixed, they were twisted into a rope core and knitted into mesh respectively, then the rope core was wrapped with the mesh to obtain wire-mesh binding scaffold.Autologous MSCs were seeded in the binding scaffold to produce scaffold-MSCs complexe.The complexe was implanted in defect of ACL in rabbits, as experimental group.Only scaffold was implanted, as control group.12 and 24 weeks postoperatively,the animals were sacrificed for HE staining of longitudinal sections of neo-ACL together with tibia or femur and biomechanical testing of newborn ACL-bone. Results Twelve weeks postoperatively, many Sharpey′s fibers were generated to form indirect stop point in experimental group. While in control group,cells lineage was disorder, and rare Sharpey′s fibers were formed.Twenty four weeks postoperatively,a structure similar to direct stop point of four areas from newborn ACL to bone was formed in experimental group.While in control group, many Sharpey′s fibers were generated to form indirect stop point.Biomechanical testing of newborn ACL-bone results showed that: 12 and 24 weeks postoperatively, the maximum load of newborn ACL-bone in experimental group were 72.7±23.4N and 121.8±34.3N,respectively,and there were statistical significance(P<0.01) compared with the control group.Conclusion The gradient degraded wire-mesh scaffold seeded with MSCs can make ACL defect get a well repair.

Anterior cruciate ligament; Repair; Mesenchymal stem cells; Gradient degraded scaffold

浙江省自然科學基金資助項目(LY13H060004)，浙江省醫(yī)學重點學科群項目生物醫(yī)藥重點學科群(XKQ-010-001)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2014ZDA005，2013KYA045)

310013 杭州，浙江省醫(yī)學科學院生物工程研究所(張文元、楊亞冬、張科技、房國堅)；浙江省醫(yī)學科學院保健食品研究所(唐靚)

張文元，電子信箱：zhangwy61@163.com

R318

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.011

2015-02-02)