ALK7基因敲除對(duì)小鼠心電圖的影響及可能機(jī)制

余太輝 胡曉軍 王 鑫 陳 卉 李 樂(lè) 唐艷紅

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ALK7基因敲除對(duì)小鼠心電圖的影響及可能機(jī)制

余太輝 胡曉軍 王 鑫 陳 卉 李 樂(lè) 唐艷紅

目的 探討ALK7基因敲除對(duì)小鼠心電圖的影響及可能機(jī)制。方法 采用8～10周的C57BL/6的野生型小鼠以及ALK7 基因敲除小鼠，使用自制皮下電極連接Powerlab系統(tǒng)記錄9:30～10時(shí)小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，使用Labchart軟件直接分析RR間期、HR、PR間期、P波寬度、QRS寬度、QT間期以及QTc，并進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)PPAR-γ的表達(dá)。結(jié)果 與正常野生型小鼠相比，ALK7基因敲除小鼠的RR間期、HR、P波脈寬、PR間期、QRS間期無(wú)明顯差異(P>0.05)，然而QT間期明顯延長(zhǎng)，QTc明顯增大(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的陽(yáng)性表達(dá)率顯著減少(P<0.05)。結(jié)論 ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的減少可能影響小鼠心室復(fù)極變化，出現(xiàn)QT間期的延長(zhǎng)。

ALK7 QT延長(zhǎng) 復(fù)極異常

激活素受體樣激酶7(ALK7)是轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族的Ⅰ型受體。主要介導(dǎo)GDF-1、GDF-3 、Nodal和Activin B這些配體的生物學(xué)效應(yīng)。ALK7所介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)胞的凋亡與增殖以及組織發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，并且參與了神經(jīng)肌肉疾病、內(nèi)分泌紊亂、肥胖、腫瘤等多種疾病[1～4]。ALK7相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)機(jī)體有一些重要的調(diào)節(jié)作用。RGS5基因敲除可引起電壓依賴(lài)性的鉀電流的重構(gòu)，延長(zhǎng)了心臟的復(fù)極情況，增加了房性以及室性心律失常的易感性等[5, 6]。由此可見(jiàn)一些基因的異?？赡苡绊懶呐K離子通道異常從而出現(xiàn)心電圖異常及心律失常。ALK7可能通過(guò)下游的多個(gè)信號(hào)通路以及效應(yīng)因子來(lái)調(diào)節(jié)心臟組織重構(gòu)和電重構(gòu)，以及影響了心肌的離子通道的異常，因此可能通過(guò)多種效應(yīng)產(chǎn)生抗心律失常等地一些作用。但ALK7在心血管疾病中的研究，特別是心律失常中的作用及其機(jī)制，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬探索ALK7敲除后對(duì)心電圖可能的影響及機(jī)制，為深入認(rèn)識(shí)心律失常的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:采用C57BL/6 品系的野生型小鼠、ALK7-/-小鼠(C57BL/6背景)各12只,8～10周。飼養(yǎng)環(huán)境符合了國(guó)家規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件要求。實(shí)驗(yàn)期間小鼠生長(zhǎng)良好，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循武漢大學(xué)人民醫(yī)院所屬的動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

2.主要儀器及試劑:PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及LabChart分析軟件(澳大利亞ADInstruments公司), Olympas BX60 光學(xué)顯微鏡，SPOT2型數(shù)碼照相機(jī)，自制皮下電極, 兔抗鼠PPAR-γ一抗、DAB顯色劑(美國(guó)Sigma公司)，羊抗兔二抗、辣根酶鏈霉素(國(guó)產(chǎn)國(guó)藥試劑公司)。

3.實(shí)驗(yàn)方法:(1)心電圖的記錄:納入的小鼠被分為ALK7基因敲除小鼠組(ALK7)以及野生小鼠組(WT)。所有小鼠在同一環(huán)境溫度下，盡量避免噪聲干擾影響，小鼠于早上9時(shí)開(kāi)始記錄，直接用自制皮下電極記錄小鼠清醒狀態(tài)下標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖(右上肢連接負(fù)電極線，左下肢連接正電極線，左上肢為參比電極)。機(jī)器提前預(yù)熱后，連接Powerlab系統(tǒng)(所有記錄模式均采用同一濾波)，待心電圖穩(wěn)定后，記錄小鼠心電圖并做好注釋?zhuān)４?:30～10:00的心電圖。(2)心電圖數(shù)據(jù)分析:使用Labchart軟件對(duì)記錄的心電圖信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析獲得下列指標(biāo)：PR間期、HR、RR間期、P波脈寬、QRS脈寬、QT間期值以及QTc (用Bazett′s公式：QTc=QT/RR1/2)。

4.標(biāo)本采集及免疫組化分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速取出心臟置于4%的甲醛溶液中固定保存，經(jīng)過(guò)常規(guī)脫蠟、脫水以及切片、封片后，將切片經(jīng)過(guò)PPAR-γ一抗以及二抗反應(yīng)顯色后(即常規(guī)免疫組化染色)在光鏡下觀察，PPAR-γ的細(xì)胞核被染成了棕褐色可認(rèn)為陽(yáng)性反應(yīng)。隨機(jī)在每張玻片上取4個(gè)清晰地視野，計(jì)算PPAR-γ地陽(yáng)性表達(dá)率：PPAR-γ細(xì)胞數(shù)占切片上所有的細(xì)胞數(shù)目計(jì)算的百分比。

結(jié) 果

1.ALK7基因敲除后心電圖的變化特點(diǎn):正常野生型小鼠與ALK7-/-小鼠的心電圖測(cè)量(圖1)。小鼠的心電圖形態(tài)(圖1A)。與正常小鼠相比， ALK7-/-小鼠的P波脈寬、PR間期、QRS間期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，然而QT間期明顯的延長(zhǎng)，QTc明顯增大(P<0.05,圖1B)。此外，小鼠的心率分布圖(圖2A)。與正常小鼠相比， ALK7-/-小鼠的RR間期及HR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2中B、C)。

圖1 ALK7基因敲除后小鼠心電圖變化A.小鼠的心電圖形態(tài)；B.小鼠的心電圖指標(biāo)的測(cè)量；兩組相比，*P<0.05

圖2 小鼠的心率分布變化、RR間期比較與HR的比較A.小鼠的心率分布變化;B.小鼠RR間期比較;C.小鼠的HR的比較

2.小鼠心肌PPAR-γ免疫組化染色:正常小鼠與ALK7-/-小鼠PPAR-γ細(xì)胞核被染成了棕褐色(圖3)。與正常小鼠相比，ALK7-/-小鼠PPAR-γ的表達(dá)率是顯著減少的(P<0.05)。WT、ALK7小鼠的PPAR-γ的陽(yáng)性表達(dá)率為34.9%±3.9%和27.9%±2.4%。

圖3 小鼠的PPAR-γ染色(免疫組化染色，×400)

討 論

心房的去極化電位變化產(chǎn)生了P波，而心房從去極化到心室開(kāi)始去極化的時(shí)間為PR間期。心室去極的電位的改變產(chǎn)生了QRS波。心室去極化以及復(fù)極化的整個(gè)時(shí)程為QT間期。QT間期的延長(zhǎng)易出現(xiàn)心律失常，然而導(dǎo)致QT的異常的原因很多。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn) ALK7基因敲除小鼠有更明顯延長(zhǎng)的QT間期。此外,免疫組化發(fā)現(xiàn)PPAR-γ的表達(dá)率顯著減少。ALK7在體內(nèi)有著重要的調(diào)節(jié)作用，可能通過(guò)下游多個(gè)信號(hào)通路和效應(yīng)子調(diào)節(jié)心臟組織重構(gòu)和電重構(gòu)，以及影響相關(guān)的心臟離子通道，從而可能有多種效應(yīng)最終產(chǎn)生抗心律失常的影響。而本研究顯示了ALK7基因敲除后小鼠心肌PPAR-γ的改變可能影響了心室的復(fù)極情況出現(xiàn)QT的延長(zhǎng)改變。

在本研究中發(fā)現(xiàn)ALK7基因敲除小鼠P波、PR間期以及QRS間期、RR間期、HR沒(méi)有明顯變化，然而QT間期明顯有延長(zhǎng)。說(shuō)明了ALK7基因敲除后可能影響了心室的復(fù)極，對(duì)心房的除極和復(fù)極以及心室的去極可能沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)中所有小鼠在同一條件下采集心電圖，發(fā)現(xiàn)ALK7基因敲除小鼠的QT間期明顯延長(zhǎng)，QTc顯著增大。因此認(rèn)為ALK7小鼠的心室肌發(fā)生了復(fù)極化的延長(zhǎng)。在長(zhǎng)QT綜合征患者中因?yàn)镮Ks通道地密度的下降從而使心肌的跨室壁的動(dòng)作電位發(fā)生了不一致地延長(zhǎng)，而且明顯的增加了復(fù)極離散度，從而產(chǎn)生了EAD，因此極容易誘導(dǎo)發(fā)生TDP[7]。心室動(dòng)作電位的時(shí)程(也就是QT間期)發(fā)生延長(zhǎng)是激動(dòng)以及折返的條件，最終會(huì)引起危及生命的惡性心律失常(比如TDP以及心室顫動(dòng)等)。有報(bào)道β受體阻滯劑可以讓QT間期的改變伴隨著心率的變化而改變，如心率加快，則QT間期會(huì)減小，因此能顯著降低復(fù)極離散度，這可能是β受體阻滯劑在心血管病中有抗心律失常作用的機(jī)制[8]。心血管病的發(fā)生率以及病死率的上升與心肌復(fù)極的延長(zhǎng)有關(guān)[9]。QTc(即心率的校正QT間期)是SCD發(fā)生心律失常的研究中常用的指標(biāo)之一。有報(bào)道顯示SCD的危險(xiǎn)因素有QTc的延長(zhǎng)[10]。而遺傳性的QT間期的變異約為35%左右[11]。因此筆者的研究顯示了ALK7基因影響了小鼠心室的復(fù)極，可能是小鼠QT延長(zhǎng)的一個(gè)影響情況，從而為惡性心律失常的研究提供新靶點(diǎn)。

PPARs是在體內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子超家族成員中的配體激活受體，在生物體內(nèi)有著重要的調(diào)節(jié)作用(如調(diào)節(jié)體內(nèi)糖平衡, 影響腫瘤生長(zhǎng)，抑制炎性因子生成及炎癥形成，以及保護(hù)心血管的效應(yīng)[12，13]；此外還能影響脂肪細(xì)胞分化以及脂肪地生成, 增加對(duì)胰島素的敏感度[14])。主要有3個(gè)亞型：PPARα、PPAR β/δ、PPARγ。目前認(rèn)為PPARγ是其中最重要的亞基之一。研究表明PPARγ在炎癥發(fā)生、動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素地抵抗和糖代謝調(diào)節(jié)、腫瘤以及肥胖等疾病中有著重要的調(diào)節(jié)作用[15～17]。ALK7可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡通過(guò)了激活Smad2/3和MAPK這兩條信號(hào)通路[18]。Zhang等[19]研究顯示，ALK7可以激活誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞的凋亡通過(guò)兩條獨(dú)立的信號(hào)通路：PI3K/Akt和Smad2/3信號(hào)通路。然而，Lu等[20]的研究發(fā)現(xiàn)抑制了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)通路可以影響心肌細(xì)胞鈉、鉀、鈣等多個(gè)的離子通道，延長(zhǎng)了細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，是藥物誘導(dǎo)的長(zhǎng)QT綜合征的重要機(jī)制。既往有研究證實(shí)，MAPK和PI3K/Akt等信號(hào)通路不僅參與了心肌肥大、凋亡、纖維化、炎癥等病理過(guò)程，還可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)下游離子通道[21]。心肌細(xì)胞動(dòng)作電位是由氯、鈉、鈣以及鉀等一些地跨膜的離子流所產(chǎn)生的一種復(fù)雜的電位變化。如果離子通道蛋白的編碼基因產(chǎn)生了一些改變，則有一部分的離子通道的結(jié)構(gòu)以及功能會(huì)有一些改變，而許多的內(nèi)向以及外向的離子流會(huì)出現(xiàn)增加或者出現(xiàn)減少的改變，最終會(huì)引起心肌的去極化以及復(fù)極化異常，從而會(huì)出現(xiàn)一些惡性心律失常。因此鈉離子以及鈣離子地內(nèi)流和鉀離子地外流地平衡情況可以影響復(fù)極的時(shí)間。當(dāng)鈉離子和鈣離子內(nèi)流發(fā)生增多，或者鉀離子的外流減少因此會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生復(fù)極減慢，心電圖則表現(xiàn)為QT間期的延長(zhǎng)。

ALK7/Smad2/3通路可通過(guò)下調(diào)PPAR-γ以及C/EBPα而減少脂肪分解，導(dǎo)致脂肪形成[22]。心臟中PPAR-γ細(xì)胞異常可能影響心臟鉀通道及鈉通道的改變。有研究顯示心臟特異性過(guò)表達(dá)PPAR-γ小鼠心肌細(xì)胞鉀通道表達(dá)降低，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，產(chǎn)生嚴(yán)重的心肌復(fù)極異常并且自發(fā)了惡性危及生命的室性心律失常[23]。可見(jiàn)PPAR-γ在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)可能引起心臟的復(fù)極異常。然而本研究中發(fā)現(xiàn)ALK7基因敲除小鼠復(fù)極異常，心肌PPAR-γ的表達(dá)明顯減少。PPAR-γ的激動(dòng)劑有利于修復(fù)在心肌地缺氧復(fù)氧模型中產(chǎn)生的損傷。有研究顯示PPAR-γ激動(dòng)劑有利于減少糖尿病相關(guān)的心肌障礙，影響鉀電流[24]。此外，有報(bào)道PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)大鼠心臟鈉通道有影響。影響鉀鈉離子通道上離子流的微小變化都會(huì)出現(xiàn)動(dòng)作電位的復(fù)極異常。因此，在本研究認(rèn)為ALK7基因敲除小鼠可能通過(guò)PPAR-γ蛋白的變化影響了鉀鈉通道的改變從而出現(xiàn)心室的復(fù)極異常。

在本研究中通過(guò)記錄ALK7-/-小鼠及正常野生型小鼠的心電圖以及PPAR-γ細(xì)胞免疫組化染色，從而發(fā)現(xiàn)ALK7-/-小鼠有著顯著延長(zhǎng)的QT間期，且QTc也是明顯的增大。此外，ALK7-/-小鼠PPAR-γ細(xì)胞在心室的陽(yáng)性率顯著減少?？紤]ALK基因敲除小鼠PPAR-γ蛋白的改變可能影響小鼠心室復(fù)極變化，出現(xiàn)QT間期的延長(zhǎng)。QT間期的改變和惡性心律失常的發(fā)生有些聯(lián)系，從而為惡性心律失常的相關(guān)基因研究提供一些研究證據(jù)。

1 Reissmann E, Jornvall H, Blokzijl A,etal. The orphan receptor ALK7 and the Activin receptor ALK4 mediate signaling by Nodal proteins during vertebrate development [J]. Genes & Development, 2001, 15(15): 2010-2022

2 Bertolino P, Holmberg R, Reissmann E,etal. Activin B receptor ALK7 is a negative regulator of pancreatic beta-cell function [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(20): 7246-7251

3 Andersson O, Korach-andre M, Reissmann E,etal. Growth/differentiation factor 3 signals through ALK7 and regulates accumulation of adipose tissue and diet-induced obesity [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(20): 7252-7256

4 Fu G, Peng C. Nodal enhances the activity of FoxO3a and its synergistic interaction with Smads to regulate cyclin G2 transcription in ovarian cancer cells [J]. Oncogene, 2011, 30(37): 3953-3966

5 QIN M, HUANG H, WANG T,etal. Absence of Rgs5 prolongs cardiac repolarization and predisposes to ventricular tachyarrhythmia in mice [J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2012, 53(6): 880-890

6 Qin M, Huang H, Wang T,etal. Atrial tachyarrhythmia in Rgs5-null mice [J]. PloS one, 2012, 7(11): e46856

7 Viskin S. Long QT syndromes and torsade de pointes [J]. Lancet, 1999, 354(9190): 1625-1633

8 Conrath CE, Wilde AA, Jongbloed RJ,etal. Gender differences in the long QT syndrome: effects of beta-adrenoceptor blockade [J]. Cardiovascular Research, 2002, 53(3): 770-776

9 Eijgelsheim M, Aarnoudse AL, Rivadeneira F,etal. Identification of a common variant at the NOS1AP locus strongly associated to QT-interval duration [J]. Human Molecular Genetics, 2009, 18(2): 347-357

10 Pfeufer A, Sanna S, Arking DE,etal. Common variants at ten loci modulate the QT interval duration in the QTSCD Study [J]. Nature Genetics, 2009, 41(4): 407-414

11 Newton-cheh C, Larson MG, Corey DC,etal. QT interval is a heritable quantitative trait with evidence of linkage to chromosome 3 in a genome-wide linkage analysis: The Framingham Heart Study [J]. Heart Rhythm , 2005, 2(3): 277-284

12 Zhu Y, Kan L, Qi C,etal. Isolation and characterization of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) interacting protein (PRIP) as a coactivator for PPAR [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(18): 13510-13516

13 Gurnell M, Wentworth JM, Agostini M,etal. A dominant-negative peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) mutant is a constitutive repressor and inhibits PPARgamma-mediated adipogenesis [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(8): 5754-5759

14 Bordji K, Grillasca JP, Gouze JN,etal. Evidence for the presence of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha and gamma and retinoid Z receptor in cartilage. PPARgamma activation modulates the effects of interleukin-1beta on rat chondrocytes [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(16): 12243-12250

15 Rocchi S, Auwerx J. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma: a versatile metabolic regulator [J]. Annals of Medicine, 1999, 31(5): 342-351

16 Gillies PS, Dunn CJ. Pioglitazone [J]. Drugs, 2000, 60(2): 333-343; discussion 44-45

17 Sugiyama Y, Murase K, Ikeda H. Mechanisms of thiazolidinedione derivatives for hypoglycemic and insulin sensitizing effects [J]. Nihon Rinsho Japanese Journal of Clinical Medicine, 2000, 58(2): 370-375

18 Kim BC, Van Gelder H, Kim TA,etal. Activin receptor-like kinase-7 induces apoptosis through activation of MAPKs in a Smad3-dependent mechanism in hepatoma cells [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(27): 28458-28465

19 Zhang N, Kumar M, Xu G,etal. Activin receptor-like kinase 7 induces apoptosis of pancreatic beta cells and beta cell lines [J]. Diabetologia, 2006, 49(3): 506-518

20 Lu Z, Wu CY, Jiang YP,etal. Suppression of phosphoinositide 3-kinase signaling and alteration of multiple ion currents in drug-induced long QT syndrome [J]. Science Translational Medicine, 2012, 4(131): 131ra50

21 Smani T, Calderon-Sanchez E, Gomez-Hurtado N,etal. Mechanisms underlying the activation of L-type calcium channels by urocortin in rat ventricular myocytes [J]. Cardiovascular Research, 2010, 87(3): 459-466

22 Yogosawa S, Izumi T. Roles of activin receptor-like kinase 7 signaling and its target, peroxisome proliferator-activated receptor gamma, in lean and obese adipocytes [J]. Adipocyte, 2013, 2(4): 246-250

23 Morrow JP, Katchman A, Son NH,etal. Mice with cardiac overexpression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma have impaired repolarization and spontaneous fatal ventricular arrhythmias [J]. Circulation, 2011, 124(25): 2812-2821

24 Nanayakkara G, Viswaprakash N, ZHONG J,etal. PPARgamma activation improves the molecular and functional components of Ⅰ(to) remodeling by angiotensin Ⅱ [J]. Current Pharmaceutical Design, 2013, 19(27): 4839-4847

(修回日期：2015-05-13)

ECG Characteristics in the ALK7-Null Mice and the Possible Mechanisms.

YuTaihui,HuXiaojun,WangXin,etal.

DepartmentofCardiology,HospitalsofTraditionalChineseandWesternMedicineinHubeiProvince,Hubei4300060,China

Objective To elucidate the effects of activin receptor-like kinase 7(ALK7) in ECG, and possible mechanism.Methods Male wildtype and ALK7-/-mice (C57BL/6 background) aged 8 to 10 weeks were used in the studies. ECG (Lead Ⅱ) was continuously recorded in consciously moving mice by homemade subcutaneous electrode from 9:30 to 10.The P-wave duration and, RR interval, PR interval and QRS duration,QT interval and QTc were measured with the Labchart software.In addition, expression of PPAR-γ were analysed by immunohistochemistry.Results There was no significant difference in P-wave duration,RR interval,PR interval and QRS duration between wildtype and ALK7-/-mice.But QT interval and QTc of ALK7-/-mice were prolonged obviously compared with wildtype mice.In addition,positive expression rate of PPAR-γ in ALK7-/-mice was significantly reduced compared with wildtype mice.Conclusion The abnormal ventricular repolarization in ALK7-/-mice may be due to reduce in expression of PPAR-γ, and results in prolonged obviously of QT interval.

ALK7-/-mice；QT interval；Abnormal repolarization

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370282)

430060 武漢，湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管內(nèi)科(余太輝、胡曉軍、王鑫、陳卉、李樂(lè))；430063 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(唐艷紅)

唐艷紅，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，電子信箱: wurmheart@vip.163.com

R541

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.008

2015-04-22)