老年大鼠糖負(fù)荷時(shí)激素的應(yīng)激性調(diào)節(jié)變化

周 珺 李茂星 王曉麗 劉文潔 賈正平 邱建國(guó) 張泉龍 張汝學(xué)

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，甘肅 蘭州 730050)

老年大鼠糖負(fù)荷時(shí)激素的應(yīng)激性調(diào)節(jié)變化

周 珺 李茂星 王曉麗1劉文潔1賈正平1邱建國(guó) 張泉龍 張汝學(xué)

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，甘肅 蘭州 730050)

目的 探討老年和成年大鼠、雌性和雄性大鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，血糖、胰島素、皮質(zhì)酮激素水平的應(yīng)激性調(diào)節(jié)變化。方法 將大鼠分為成年雄性、成年雄性、老年雄性、老年雌性組，在葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別于0、30、60、120 min采血，測(cè)定血糖值、胰島素、皮質(zhì)酮水平。計(jì)算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMAβ)和?I30/?G30。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死所有大鼠，測(cè)定臟器指數(shù)、胰島素、皮質(zhì)酮水平。結(jié)果 相比較成年雄性大鼠，老年雌性大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖水平升高，30 min胰島素水平顯著降低(P<0.01)，0、30 min皮質(zhì)酮水平降低(P<0.01)，60、120 min胰島素減少、皮質(zhì)酮水平升高、臟器指數(shù)下降。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30、60、120 min血糖水平升高(P<0.05)、胰島素減少，各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)酮均顯著升高(P<0.05)，臟器指數(shù)均下降(P<0.05)?；A(chǔ)胰島素分泌功能強(qiáng)弱順序：成年雌性大鼠>老年雌性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠。早期胰島素分泌功能強(qiáng)弱順序：成年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠>老年雌性大鼠。結(jié)論 老年大鼠胰島素發(fā)揮作用具有延時(shí)或胰島素敏感性下降的特點(diǎn)，尤其是老年雌性大鼠。不同性別老年大鼠皮質(zhì)酮反應(yīng)性不同，機(jī)體臟器均有萎縮，基礎(chǔ)和早期胰島素分泌功能均較差。

糖耐量試驗(yàn)；血糖；胰島素；皮質(zhì)酮

葡萄糖耐量進(jìn)行性降低與老化呈正比關(guān)系，糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病(T2DM)在老年人中發(fā)病率顯著升高〔1〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的高活性與老化相關(guān)的認(rèn)知功能下降以及神經(jīng)元存活的狀況密切相關(guān)，衰老導(dǎo)致的HPA軸缺損在同種系內(nèi)部廣泛存在。有證據(jù)表明，糖皮質(zhì)激素的調(diào)控在老化過(guò)程中受損，這與衰老導(dǎo)致的心血管事件、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)〔2〕。前期研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者HPA軸的功能異常，糖皮質(zhì)激素的調(diào)節(jié)受損程度與糖化血紅蛋白(HbA1c)水平密切相關(guān)〔3〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，相比較成年大鼠和中年大鼠，老年大鼠的促腎腺皮質(zhì)激素釋放激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)水平在應(yīng)激刺激下的反應(yīng)性個(gè)體差異特別大〔4〕，HPA軸功能正常對(duì)大鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)必不可少〔5〕。本實(shí)驗(yàn)擬初步了解在葡萄糖負(fù)荷的應(yīng)激刺激下不同時(shí)間點(diǎn)，老年大鼠和成年大鼠、雌性大鼠和雄性大鼠胰島素和皮質(zhì)激素的變化情況，分析糖皮質(zhì)激素調(diào)控的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性、雌性14周齡大鼠各10只，體重(180±10)g分別為成年雄性組、成年雌性組；Wistar雄性、雌性60周齡大鼠各10只，體重(400±10)g為老年雄性組；Wistar雌性60周齡大鼠10只，體重(200±10)g為老年雌性組。所用大鼠均由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2009-0004，動(dòng)物合格證號(hào)：No.0000789，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，普通飼料由該實(shí)驗(yàn)科自行配制，自由攝食進(jìn)水，室溫19℃～24℃。所有大鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 w。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Vitalab 21半自動(dòng)生化分析儀，荷蘭Vital Scientific公司；BP210S電子天平，賽多利斯有限公司；HP-8453紫外分光光度計(jì)，美國(guó)惠普公司；IEC MICROMAX離心機(jī)，美國(guó)Thermo Electron公司；SN-682放射免疫γ-計(jì)數(shù)器，中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所日環(huán)儀器廠。

1.3 藥品與試劑 血糖檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：1211105)購(gòu)自四川省邁克科技有限責(zé)任公司；50%葡萄糖注射液(批號(hào):10041108)，湖南中南科倫藥業(yè)有限公司；胰島素(FINS)放射免疫分析試劑盒(批號(hào)：20101120)、CORT放射免疫分析試劑盒(批號(hào)：20100920)為天津九鼎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)測(cè)定 大鼠禁食6 h，乙醚麻醉后眼眶靜脈叢采血，測(cè)定空腹血糖，即為0 min血糖。腹腔一次性注射葡萄糖溶液2.5 g/kg，分別于注射后30、60、120 min采血，測(cè)定血糖值。血糖用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。

1.4.2 血漿FINS及CORT含量測(cè)定 糖耐量實(shí)驗(yàn)0、 30、60、120 min的血樣以及大鼠處死后血樣用肝素鈉抗凝后，6 000 r/min離心4 min后分裝待測(cè)，血漿FINS、CORT含量用放射免疫法進(jìn)行測(cè)定，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.3 臟器指數(shù)測(cè)定 處死大鼠后立即解剖并取出相應(yīng)臟器，洗凈后稱重(內(nèi)臟指數(shù)=內(nèi)臟重/體重×100%)。

1.4.4 早期和基礎(chǔ)胰島素分泌功能 采用HOMAβ反映基礎(chǔ)胰島素分泌功能〔6〕：HOMAβ= 20×Ⅰ0/(G0-3.5)。采用?Ⅰ30/?G30反映早期胰島素分泌功能〔7〕：?Ⅰ30/?G30=(Ⅰ30-Ⅰ0)/(G30-G0)。

2 結(jié) 果

2.1 OGTT過(guò)程中血糖水平的變化 在OGTT中，相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖水平升高，但僅0、60、120 min血糖水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30、60、120 min血糖水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，且老年雌性大鼠的60、120 min血糖水平均高于老年雄性大鼠。見(jiàn)表1。

2.2 OGTT過(guò)程中FINS水平的變化 在OGTT中，相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的30 min FINS水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min在葡萄糖刺激下生成FINS均不同程度的減少。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30 min FINS水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min在葡萄糖刺激下生成FINS均不同程度減少。各組大鼠處死后的血漿胰島素水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 OGTT過(guò)程中CORT水平的變化 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的0、30 min CORT水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min CORT水平升高，與成年雄性大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的0、30、60、120 min CORT水平均顯著升高(P<0.05)。處死后，老年雌性大鼠的血漿CORT水平仍顯著高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表1 各組OGTT過(guò)程中血糖水平的變化

與成年雄性組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與成年雌性組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與老年雄性組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；下表同

表2 OGTT過(guò)程中FINS水平的變化

表3 各組OGTT過(guò)程中CORT水平的變化

2.4 臟器指數(shù)的變化 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的肝臟指數(shù)顯著下降(P<0.01)，脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、腎上腺指數(shù)均不同程度的下降。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、腎上腺指數(shù)均顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組臟器指數(shù)的變化±s)

2.5 基礎(chǔ)和早期胰島素分泌功能評(píng)價(jià) 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠和成年雌性大鼠的HOMAβ下降，同時(shí)，其他各組?Ⅰ30/?G30均下降；相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的HOMAβ升高，?Ⅰ30/?G30下降。說(shuō)明基礎(chǔ)胰島素分泌功能強(qiáng)弱順序：成年雄性大鼠>老年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠。早期胰島素分泌功能強(qiáng)弱順序：成年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠>老年雌性大鼠。見(jiàn)表5。

表5 各組基礎(chǔ)和早期胰島素分泌功能評(píng)價(jià)±s)

3 討 論

葡萄糖耐量減弱與老化密切相關(guān)，老齡化導(dǎo)致IGT和T2DM在老年人中發(fā)病率升高〔1〕。導(dǎo)致這種情況的主要原因是各種原因?qū)е碌睦夏昊颊咂咸烟抢脺p少以及葡萄糖來(lái)源增加。HPA軸的高活性與老化相關(guān)的認(rèn)知功能下降、機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)障礙等密切相關(guān)，衰老可導(dǎo)致HPA軸功能紊亂，糖皮質(zhì)激素調(diào)控異常〔2〕。HPA軸功能正常對(duì)大鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)必不可少〔5〕，但是很少有人知道這個(gè)內(nèi)分泌軸在衰老大鼠糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面的重要性以及此軸的性別差異。

隨著年齡的增加，老年化常伴隨葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損程度的增加以及T2DM發(fā)生率增加。隨著衰老的加重，胰島β細(xì)胞的分泌功能降低〔8〕。研究證實(shí)，在老年人群中，許多和老化相關(guān)因素之間的相互作用都可促進(jìn)老化相關(guān)的改變，這些在OGTT過(guò)程中都可以得到體現(xiàn)〔9〕。Gu等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，胰島β細(xì)胞功能逐漸下降，老年大鼠β細(xì)胞增殖減少且凋亡的β細(xì)胞頻率顯著增加，β細(xì)胞的FINS分泌功能降低。

本實(shí)驗(yàn)間接說(shuō)明HPA軸的功能狀態(tài)不同，差異較大。主要原因?yàn)槔夏甏笫笈K器一定程度萎縮、臟器功能減弱以及其他激素調(diào)節(jié)失衡的間接影響。

葡萄糖耐量降低存在胰島素β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗等病理生理狀態(tài)，且具有血管病變的多種風(fēng)險(xiǎn)因子的臨床特點(diǎn)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)一次性注射大劑量的葡萄糖對(duì)大鼠機(jī)體也是一種應(yīng)激刺激，在這種應(yīng)激刺激下，衰老大鼠出現(xiàn)腎上腺束狀帶細(xì)胞肥大，下丘腦區(qū)域神經(jīng)元缺損，海馬糖皮質(zhì)激素受體減少，血中ACTH和糖皮質(zhì)激素水平升高，下丘腦CRH釋放增加；給予地塞米松后內(nèi)源性GC的抑制作用減弱，對(duì)慢性應(yīng)激反應(yīng)性的緩解性降低。根據(jù)GC級(jí)聯(lián)作用的假設(shè)，應(yīng)激刺激和GC促進(jìn)大鼠的老化。應(yīng)激誘導(dǎo)海馬組織糖皮質(zhì)激素受體下調(diào)，然后使應(yīng)激誘導(dǎo)的HPA軸激活GC負(fù)反饋受損，最終CORT的基礎(chǔ)水平升高以及應(yīng)激刺激的GC分泌增加。由于海馬的激活減弱HPA軸功能，GC濃度過(guò)度升高以及海馬組織內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體水平降低可逐步減弱其負(fù)反饋機(jī)制并使應(yīng)激反應(yīng)性遲鈍〔5〕。

綜上，老年雌鼠對(duì)應(yīng)激刺激的敏感性依舊存在，主要表現(xiàn)為HPA軸功能亢進(jìn)，而老年雄鼠更多地表現(xiàn)為HPA軸過(guò)分亢進(jìn)最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的耗竭。老年雌性大鼠比老年雄性大鼠更加嚴(yán)重的原因很可能是由于性激素的差異。

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〔2014-08-20修回〕

(編輯 徐 杰)

Changes of hormonal stressful regulation of older rats in glucose-tolerance

ZHOU Jun，LI Mao-Xing,WANG Xiao-Li，etal.

Key Laboratory of Prevention and Cure for Plateau Environment Damage，PLA;Clinical Pharmacy Key Discipline of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，Gansu，China

Objective To investigate the blood glucose，insulin level and corticosterone levels variation in glucose tolerance test between older and younger rats，male and female rats，to explore the stressful regulation changes of these hormones.Methods Rats were divided into four groups:adults male，adults female，older male，older female. The glucose tolerance test was conducted，the rat’s blood was collected at 0，30，60，120 min each point，the levels of glucose，insulin and corticosterone were measured. After experiment，all rats were decapitated，the levels of insulin and corticosterone were measured，and the organ indexes were assayed. Then the HOMAβ and △I30/△G30were accounted.Results In glucose tolerance test，compared with that of adults male rats，older male rats’ blood glucose levels was raised at each time point，its insulin levels at 30 min was significantly decreased(P<0.01)，while at 60 and 120 min also decreased，the corticosterone levels was reduced notably at 0 and 30 min(P<0.01)，while increased at 60 and 120 min，organ index lowered in different degree. Compared with those of adults female rats，older female rats’ blood glucose level was raised significantly at 30，60，120 min(P<0.05)，its insulin level at 30 min was significantly decreased(P<0.01)，while at 60 and 120 min also decreased，the corticosterone level was increased notably at each time point(P<0.05). After death，the corticosterone level was higher than that of other groups(P<0.01)，the organ indexes were decreased notably(P<0.05). The order of basal insulin secretion function:adult male >older female > adult female > older male. The order of prophase insulin secretion function:adult male > adult female > older male > older female.Conclusions Insulin is delayed to produce a marked effect or the sensitivity is declined in older rats，especially the older female rats. The corticosterone levels variation in different gender，the organ indexes are atrophy，and the insulin secretion function in basal and prophase is declined.

Glucose tolerance test;Blood glucose;Insulin;Corticosterone

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173620，30772773)

張汝學(xué)(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事內(nèi)分泌代謝藥理學(xué)研究。

周 珺(1986-)，女，藥師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究。

R335

〔文章編號(hào)〕 1005-9202(2015)12-3191-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.003

1 蘭州大學(xué)藥學(xué)院