甘蔗組培苗繼代增殖的淺層培養(yǎng)

謝君鋒等

摘 要 甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用為甘蔗品種的快速繁殖和良種推廣提供了有效的手段，而淺層培養(yǎng)作為植物組培技術(shù)的一種，可為完善甘蔗組培苗增殖培養(yǎng)提供不同的解決途徑，在不降低增殖效果的前提下，降低培養(yǎng)基的使用量，從而降低生產(chǎn)成本。本試驗(yàn)在使用相同配方[MS液體培養(yǎng)基（30 g/L的蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）pH 6.0]、不同容量的培養(yǎng)基對甘蔗組培苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，并觀察對比其增殖效果，以確認(rèn)淺層培養(yǎng)是否具有較好的增殖效果。結(jié)果表明：在增殖F2～F5代的培養(yǎng)中，果醬瓶中加入10 mL容量的液體培養(yǎng)基較常用的20 mL容量的液體培養(yǎng)基增殖效果明顯。

關(guān)鍵詞 甘蔗組培 ；繼代增殖 ；淺層培養(yǎng)

分類號 S566.1

Abstract The application of sugarcane tissue culture technique for rapid propagation of sugarcane varieties and improved varieties and provide effective means， and the shallow layer culture as a kind of plant tissue culture techniques， can provide different solutions to improve the proliferation of sugarcane tissue culture seedling culture， does not reduce the proliferation effect of the premise， reduces the medium usage， furtherto reduce the production cost； the test using the same formula [（MS liquid medium， sucrose 30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）， pH 6] under different capacity of the medium of sugarcane tissue culture seedlings were cultured to observe the proliferation， the proliferation effect of contrast， to confirm whether the shallow layer culture has good effect through proliferation； experiment showed that， proliferation of cultured in the F2～F5 generation in a jam jar， add 10 mL capacity of the liquid culture medium proliferation effect of commonly used 20 mL capacity of liquid obviously.

Keywords sugarcane tissue ； subculture multiplication ； thin layer liquid tissue

甘蔗是第一個組織培養(yǎng)成功的禾本科植物[1]。作為中國最主要的糖料作物，其產(chǎn)糖量占全國總產(chǎn)糖量的90%以上[2]。甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用為甘蔗品種的快速繁殖和良種推廣提供了有效的手段。淺層培養(yǎng)作為植物組培技術(shù)的一種，可為完善甘蔗組培苗增殖培養(yǎng)提供不同的解決途徑。1934年，美國學(xué)者White等用番茄根進(jìn)行組織培養(yǎng)，首次建立了活躍生長的無性繁殖系[3]。1969年，Barba等及Heinz等[4-5]從甘蔗組培培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)植株再生。1978年，廣西區(qū)甘蔗組織培養(yǎng)苗協(xié)作組對甘蔗組培體系進(jìn)行了系統(tǒng)闡述，其中明確提出了使用蔗筍進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、分化、增殖的組培工廠生產(chǎn)體系[6]，該體系為甘蔗組培生產(chǎn)常用的體系。1992年，何明等[7]闡明了甘蔗組培的3種常用方法：液體微繁殖法、固培及早生根誘導(dǎo)法和固液雙層培養(yǎng)法，其中液體微繁殖法為甘蔗組培工廠生產(chǎn)中的常用方法，其核心是使用液體培養(yǎng)基對甘蔗組培苗進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，但文章中并未提及培養(yǎng)基使用量的問題。1980年，周萍[8]首次提出了使用液體淺層培養(yǎng)可誘導(dǎo)煙草愈傷組織，為植物組織培養(yǎng)提供了新的思路。1999年，程麗芬[9]提到了在組培過程中使用廣口果醬瓶替代常用的三角瓶可降低試驗(yàn)成本。自2000年起，廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所經(jīng)濟(jì)組培研究室的組培工廠開始大規(guī)模使用果醬瓶進(jìn)行甘蔗組培苗生產(chǎn)。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了液體淺層培養(yǎng)的嘗試，通過淺層培養(yǎng)達(dá)到在不降低增殖效果的前提下，降低培養(yǎng)基的使用量，從而降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗品種為新臺糖22號。挑選生長整齊的增殖F2代瓶苗進(jìn)行對比試驗(yàn)。試驗(yàn)采用的增殖瓶苗獲得的途徑為：心葉愈傷組織誘導(dǎo)→分化→增殖F1[5，10]。

1.2 方法

1.2.1 來源瓶苗培養(yǎng)基的配方

心葉愈傷組織培養(yǎng)基配方為：MS固體培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L+2.5 mg/L 2，4-D，pH 6.0）；分化培養(yǎng)基配方為：MS固體培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，pH 6.0）；增殖F1培養(yǎng)基配方為：MS液體培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH 6.0）[11]。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將增殖F1培養(yǎng)基配方分別按10 mL/瓶（A處理）、20 mL/瓶（B處理）、5 mL/瓶（C處理）共3個處理添加進(jìn)果醬瓶中，消毒備用。在組培工廠中分別挑選4名熟練工人進(jìn)行增殖操作，對4人分別編號為：I、II、III、IV（圖1）。選取若干瓶生長勻齊的增殖F1瓶苗分別接入培養(yǎng)基中進(jìn)行相同條件的繼代增殖培養(yǎng)。

1.2.3 生長條件

甘蔗繼代增殖培養(yǎng)條件為：恒溫26℃，光照1 500 lx持續(xù)12 h[12]，嚴(yán)格按照甘蔗組培工廠的操作規(guī)范（圖2），控制污染率低于5%[13]。

1.2.4 接種方法

在無菌環(huán)境下，每次換代增殖時，均使用鑷子對叢生芽苗進(jìn)行清理分類，接入新的培養(yǎng)基中[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增殖結(jié)果

每個工人接種起步為100瓶，按照嚴(yán)格的甘蔗組培途徑，經(jīng)過4代增殖后，統(tǒng)計(jì)增殖結(jié)果見表1（表1數(shù)據(jù)已剔除相應(yīng)的污染數(shù)）。根據(jù)表1所示內(nèi)容，直觀對比，C處理在F2→F3階段便已經(jīng)出現(xiàn)較大波動，后期數(shù)據(jù)已經(jīng)呈現(xiàn)出下降趨勢，這說明C處理不適合甘蔗組培苗的規(guī)?；a(chǎn)，可以剔除數(shù)據(jù)分析。相比C處理，A處理與B處理在各個階段的數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)上升趨勢，但略有差異，可進(jìn)一步對這2個處理進(jìn)行方差分析。經(jīng)過數(shù)代增殖后，A處理與B處理的F4→F5出現(xiàn)較為明顯的單瓶差異（圖3）。

2.2 增殖與工人間的誤差分析

本試驗(yàn)使用工人共4名，對其進(jìn)行試驗(yàn)誤差分析，以排除試驗(yàn)結(jié)果的人為因素，保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。使用SPSS 19.0對統(tǒng)計(jì)表進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表2。F2→F3與工人組間差異的顯著性為0.87>0.05，根據(jù)SPPS的評測標(biāo)準(zhǔn)，即F2→F3與工人組間差異不顯著，同理F3→F4與工人、F4→F5與工人顯著性均大于標(biāo)準(zhǔn)判斷值0.05，即說明在整個增殖試驗(yàn)期間，相同增殖代數(shù)，接種工人之間并不存在較大差異。所以試驗(yàn)結(jié)果可排除由工人不同而造成的誤差干擾。

2.3 處理間的方差分析

由表1可知，試驗(yàn)處理間存在差異，通過SPSS分析軟件，對不同增殖階段的A、B處理間進(jìn)行差異分析，結(jié)果見表3和表4。

試驗(yàn)結(jié)果顯示：F2→F3處理組間的差異顯著性為0.004<0.05；F3→F4處理組間的差異顯著性為0.001<0.05；F4→F5處理組間的差異顯著性為0.000<0.05。說明在整個增殖期間，A處理與B處理均達(dá)到了差異顯著性水平，而且顯著性隨著增殖代數(shù)的不斷增加呈上升趨勢。對比表4和表1數(shù)據(jù)可得，A處理增殖效果明顯高于B處理。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，5 mL培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)不適合甘蔗組培苗的增殖生長，而10 mL培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)增殖效果明顯高于20 mL普通培養(yǎng)基的增殖效果。

甘蔗組培苗的增殖方法為叢生芽分蘗增殖，是在一團(tuán)原生質(zhì)上進(jìn)行不斷的分生而形成的一種增殖方式，甘蔗組培苗的分生點(diǎn)較低，處于增殖苗的底部，過量的液體容易淹埋甘蔗組培苗的分生點(diǎn)使其生長緩慢。使用傳統(tǒng)的20 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)方法會完全淹沒甘蔗組培苗的分生點(diǎn)，不利于新生成的叢生芽的快速萌發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致了在相同時間內(nèi)叢生芽數(shù)的不足；前期對叢生芽芽數(shù)的減少影響不大，經(jīng)過多代的增殖，苗數(shù)的增加，影響效果越來越明顯，便會影響甘蔗組培苗的增殖率。而淺層培養(yǎng)并沒有完全淹沒叢生芽的分生點(diǎn)，不僅能有效的吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)與激素，亦能給原生質(zhì)提供有效的伸展空間，繼而保證了叢生芽的萌發(fā)及增殖率。但淺層培養(yǎng)并非過于少量的培養(yǎng)基容量，過于少量的培養(yǎng)基（C處理）會造成營養(yǎng)與激素供應(yīng)不足，從而影響甘蔗組培苗的生長。因此，10 mL是甘蔗組培苗淺層培養(yǎng)基的最適容量。

參考文獻(xiàn)

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