金銀花不同品種間遺傳變異的ISSR分析

王湘瑩，何 鋼，王曉明，喬中全

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

金銀花不同品種間遺傳變異的ISSR分析

王湘瑩1，何 鋼1，王曉明2，喬中全2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)金銀花不同品種的遺傳變異進(jìn)行了研究。從100個(gè)引物中篩選出10個(gè)重復(fù)性高、擴(kuò)增效果好的引物，對(duì)23個(gè)金銀花品種的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得174條穩(wěn)定的譜帶，其中多態(tài)性條帶169條，多態(tài)性比率為97.1%，23個(gè)金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.471 3～0.100 0之間，平均遺傳相似數(shù)為0.629 9，平均基因多樣度(He)和Shannon多樣性指數(shù)分別是0.379 3和0.556 3，表明品種間的遺傳基礎(chǔ)較寬及遺傳多樣性較高。聚類分析(UPGMA)表明：23個(gè)供試金銀花品種劃分為忍冬、美國(guó)忍冬、灰氈毛忍冬3大類?？梢姡?ISSR標(biāo)記可有效地分析金銀花種質(zhì)資源的遺傳變異，為金銀花品種鑒別、分類、種質(zhì)資源的有效利用提供理論依據(jù)。

金銀花；遺傳變異；親緣關(guān)系；ISSR分析

金銀花Lonicera japonica，忍冬科CaPrifoliaeeae忍冬屬Lonicera植物，又名雙花，主要包括灰氈毛忍冬、忍冬、紅腺忍冬、毛花柱忍冬、山銀花等，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有保肝、消炎、抗衰老、抗病毒、清熱解毒等生物學(xué)活性作用[1-3]，已被廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、香料、飲料、保健品等領(lǐng)域[4]。我國(guó)的金銀花地方品種資源非常豐富，但優(yōu)良品種很少，各個(gè)地方種植的金銀花品種混雜，良莠不齊，同物異名、同名異物的現(xiàn)象在各地都有出現(xiàn)[5]，嚴(yán)重影響金銀花新品種的推廣及整個(gè)產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，同時(shí)也制約了金銀花良種選育的進(jìn)程。因此，研究金銀花品種間遺傳變異對(duì)金銀花的品種鑒定、品種改良、生產(chǎn)實(shí)踐和引種等均具有重要意義。DNA分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物和微生物的遺傳多樣性研究，它從分子水平進(jìn)行生物遺傳多樣性分析[6]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)于利用RAPD分子標(biāo)記與同工酶、DNA序列分析進(jìn)行金銀花種質(zhì)鑒 定[7-8]的報(bào)道，也有利用PCR技術(shù)對(duì)細(xì)氈毛忍冬、金銀花和山銀花的5S-rRNA基因間區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，研究道地與非道地藥材之間的遺傳距離[9]。但是，目前較少有人利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行金銀花遺傳變異分析。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)克服了RAPD和RFLP兩種標(biāo)記技術(shù)的局限性[10-11]，具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好及成本低等特點(diǎn)，可以檢測(cè)出豐富的遺傳多樣性。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)23份金銀花品種進(jìn)行標(biāo)記，分析了金銀花品種間及花瑤晚熟新品種組培過程的遺傳變異，建立了金銀花不同品種的DNA指紋圖譜，為金銀花品種鑒定、種質(zhì)資源的保存和利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料是23個(gè)金銀花品種的新鮮葉片（見表1），所有供試材料均采自湖南省林業(yè)科學(xué)院金銀花種質(zhì)資源收集圃。采集后的新鮮葉片置于液氮中保存帶回，并將其保存在-80℃冰箱中備用。

表1 23份金銀花資源的名稱及來源Table 1 Names and origins of 23 Lonicera japonica used in this study

1.2 基因組 DNA 的提取

基因組DNA的提取按照北京天根生物有限公司的植物DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit）的說明書進(jìn)行。

1.3 ISSR 引物退火溫度及多態(tài)性篩選

試驗(yàn)所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia Biotechnology,UBC）公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。從100條引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的10條引物（見表2）。參考不同引物的Tm值，采用梯度PCR確定相應(yīng)的退火溫度，以‘花瑤晚熟’原種、‘金翠蕾’2個(gè)品種為模板，分別在45～65 ℃之間設(shè)置12個(gè)梯度溫度，通過1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，以擴(kuò)增帶型清楚、多態(tài)性好且雜帶較少的溫度作為該引物的退火溫度。

表2 ISSR引物名稱及序列Table 2 Names, sequences of ISSR primers

1.4 ISSR-PCR 擴(kuò)增

參照已有的ISSR-PCR 體系[12]，采用個(gè)人 型 普 通 PCR儀（eppendorf、Mastercycler Personal）。20 μL 反 應(yīng) 體 系：1×PCR buffer（Mg2+free），1.5 U TaqDNA聚合酶，0.15 mmol/L dNTPs，0.4 μmol/L 引 物，1.5 mmol/L MgCl2，60 ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min； 94℃30 s，48～56℃（不同引物有其特異退火溫度）30 s，72℃ 1.5 min， 35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。ISSR-PCR 產(chǎn)物在1×TAE 緩沖液中，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓設(shè)定為90 V，電泳35 min。EB染色，G：box EF2凝膠成像儀拍照記錄。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次以上。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物每個(gè)條帶看作1個(gè)等位基因。清晰度高、重復(fù)性好、分辨率高的條帶用于分析，按條帶的有或 無分別記為1或0，即有條 帶記為1，無條帶記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。用Popgene32分析軟件計(jì)算不同品種間的基因多樣度、Shannon信息指數(shù)等。用NTsys2.10分析軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析，采用Nei 氏[13]計(jì)算各個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)I（I=2mxy/mx+my，其中mxy為第x個(gè)材料和第y個(gè)材料共有的條帶數(shù)，mx和my分別為第x個(gè)材料和第y個(gè)材料各自的總擴(kuò)增帶數(shù)）和遺傳距離D（D=1-I），并用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性

在金銀花23個(gè)樣本中，10個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出174條清晰、重復(fù)性好、分比率高的條帶，分子量為200～2 000 bp（見表3，圖1）。其中169條為多態(tài)性條帶，不同引物擴(kuò)增條帶數(shù)12～22條不等，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出17.4條帶，平均每個(gè)ISSR引物可獲得16.9條多態(tài)譜帶，多態(tài)性比率（PPB）為97.1%。

表3 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性Table 3 Amplification results and polymorphism of intersimple sequence repeat (ISSR) primers used in this study

圖1 UBC836 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified result of primer UBC836

2.2 金銀花品種間遺傳多樣性

遺傳多樣度和香農(nóng)（shannon）信息指數(shù)是衡量生物遺傳多樣性的兩個(gè)重要指標(biāo)，根據(jù)ISSR引物所揭示的多態(tài)性，計(jì)算得到金銀花品種間遺傳多樣性情況（見表4），品種間平均基因多樣度（He）和shannon多樣性指數(shù)分別是0.379 3和0.556 3，表明金銀花品種間遺傳多樣性較高，存在豐富的遺傳變異，這與從表型性狀層次的分析是一致的。

2.3 遺傳相似性分析與聚類分析

根據(jù)ISSR引物擴(kuò)增出的條帶，按照Nei’s公式，計(jì)算23個(gè)金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)（見表5）。23個(gè)家系間遺傳相似系數(shù)值變化范圍是0.471 3～0.100 0，平均遺傳相似性系數(shù)為0.629 9，表明品種間的遺傳基礎(chǔ)較寬及遺傳多樣性較高。其中，‘銀翠蕾’與‘龍花’兩品種間的遺傳相似數(shù)為0.856 3，親緣關(guān)系較進(jìn)；‘Americana’與‘抗7 ’遺傳相似度為0.471 3，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)?！ì幫硎臁N與‘花瑤晚熟1號(hào)’（繼代10次組培苗）、‘花瑤晚熟2號(hào)’（繼代20次組培苗）遺傳相似度為1.000 0，表明‘花瑤晚熟’原種與‘花瑤晚熟’組培苗沒有發(fā)生遺傳變異，組織培養(yǎng)繼代次數(shù)達(dá)到20次時(shí)沒有發(fā)生遺傳變異，至于繼代次數(shù)20次以后有沒發(fā)生變異及什么時(shí)候發(fā)生變異還需做進(jìn)一步的研究。

表4 23個(gè)金銀花品種的遺傳多樣性評(píng)估Table 4 Genetic diversities estimation for 23 Lonicerajaponica species

表5 金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficients of 23 honeysuckle cultivars

根據(jù)品種間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA法進(jìn)行聚類分析，從聚類圖（見圖2）可以看出，利用ISSR分子標(biāo)記，在相似性系數(shù)為0.56時(shí)，可將23品種分為3個(gè)大的類群，第一類包括‘金豐1號(hào)’、‘九豐1號(hào)’、‘Honcsyrose’、‘Etrusca Superba’4個(gè)品種，為忍冬種群，每個(gè)花梗上只有2個(gè)花管，花管絨毛較多，綠色；第二類包括‘Blanche Sandman’、‘Americana’2個(gè)品種，為美國(guó)忍冬種群，每個(gè)花梗上只有2個(gè)花管，花管絨毛較多，紅色；第三類包括‘抗5’、‘抗6’、‘抗7’、‘抗8’、‘抗9’、‘抗10’、‘龍花’、‘龍2號(hào)’、‘龍3號(hào)’、‘龍9號(hào)’、‘白云’、‘湘蕾’、‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’、‘花瑤晚熟’、‘花瑤晚熟1號(hào)’、‘花瑤晚熟2號(hào)’17個(gè)品種，為灰氈毛忍冬種群，花梗上簇生多個(gè)花管（10個(gè)以上），花管表面光潔，無毛。聚類結(jié)果能充分說明品種間的親緣關(guān)系。

圖2 金銀花品種資源ISSR分子聚類分析Fig.2 Dendrogram of UPGMA cluster f or 23 honeysuckle cultivars based on ISSR Markers

3 結(jié) 論

ISSR分子標(biāo)記能靈敏地揭示兩個(gè)親緣關(guān)系十分相近個(gè)體間的差異[13]，同時(shí)因?yàn)镮SSR引物較長(zhǎng)（16～25 bp），使PCR擴(kuò)增退火溫度較高，擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性好[14-15]，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，特別是在輔助育種方面。另外，ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)金銀花種質(zhì)資源多樣性研究結(jié)果證明它是一種非常有效的工具[16]。

本研究用10條ISSR引物對(duì)23份金銀花品種資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出174條清晰、重復(fù)性好的普帶，169條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為97.1%，這表明金銀花種質(zhì)資源擁有豐富的遺傳多樣性。同時(shí)也建立了金銀花不同品種的DNA指紋圖譜，為金銀花品種鑒定、種質(zhì)資源的保存和利用提供理論依據(jù)。

另外，本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘花瑤晚熟’新品種組織培養(yǎng)過程中遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，‘花瑤晚熟’原種與‘花瑤晚熟1號(hào)’（繼代10次組培苗）、‘花瑤晚熟2號(hào)’（繼代20次組培苗）遺傳相似度為1.000 0，表明‘花瑤晚熟’原種與‘花瑤晚熟’組培苗沒有發(fā)生遺傳變異，組織培養(yǎng)繼代次數(shù)達(dá)到20次時(shí)沒有發(fā)生遺傳變異，至于繼代次數(shù)20次以后有沒發(fā)生變異及什么時(shí)候發(fā)生變異還需做進(jìn)一步的研究。因此，ISSR分子標(biāo)記可以從分子水平為金銀花新品種的組織培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

[1] 王天志,李永梅.金銀花的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2000,15(4):292-298.

[2] 中國(guó)藥材公司.中國(guó)中藥資源志要[M].北京:科學(xué)出版社,1994.

[3] 王曉明,李永欣,聶啟英.金銀花組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].湖南林業(yè)科技,2006,33(4):1-3.

[4] 石 鉞,石任兵,陸蘊(yùn)如.我國(guó)藥用金銀花資源、化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1999,34(11):23-35.

[5] 郭巧生.藥用植物栽培學(xué)[M ].北京:高等教育出版社, 2004:353-361.

[6] 周延清. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M ].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

[7] 石俊英,于燕莉,盧 燕. PAPD和POD分析技術(shù)在金銀花品種鑒定中的應(yīng)用[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,25(2):137-138.

[8] 于燕莉,石俊英.脫氧核糖核酸序列分析在金銀花品種鑒定中應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2001,12(2):136-137.

[9] 李 萍,蔡朝暉,邢俊波. 5S-rRNA基因間區(qū)序列變異用于金銀花藥材道地性研究初探[J].中草藥, 2001,32(9):835-837.

[10] 原勤勤,文亞峰,劉 儒,等.棗優(yōu)良品種親緣關(guān)系的ISSR分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2012, 30(1):56-61.

[11] 王弦云,朱曉敏,王 勤,等.杜仲ISSR- PCR反應(yīng)體系的建立與引物篩選及其在遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013, 31(1):30-34.

[12] 王曉明,李俊彬,李永欣,等.金銀花 ISSR- PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(11): 73-77.

[13] Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, 70: 3321-3323.

[13] Wolfe A D, Liston A. Contributions of the polymerase chain reaction to plant systematics[C]// Soltis D E, Soltis P S, Doyle J J. Molecular Systematics of Plants: II. DNA Sequencing. New York: Kluwer Academic Publisher, 1998: 43-86.

[14] Fang D Q, Rocse M L, Krueger R R, et al. Fingerprinting trifoliate orange germplasm accessions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers[J]. Theor. Appl. Genet.,1997, 95: 211-219.

[15] Moreno S, Martin J P, Ortiz M. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm [J]. Euphytica, l998, 101: 117-125.

[16] 王曉明,謝碧霞,李俊彬,等.金銀花ISSR分子標(biāo)記及遺傳多樣性分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(6):14-18.

ISSR analysis on genetic variations among different varieties of Lonicera japonica

WANG Xiang-ying1, HE Gang1, WANG Xiao-ming2, QIAO Zhong-quan2

(1. School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Forestry Academy, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ The genetic variation of different varieties of Lonicera japonica was analyzed by inter-simple sequence repeats (ISSR). Ten ISSR primers with high polymorphic and clear bands were filtered and utilized for testing the genetic variance of 23 Lonicera japonica varieties. The results demonstrate that 174 DNA fragments were amplified, among which 169 DNA bands were polymorphic with the ratio of polymorphism 97.1%, 23 genetic similarity coefficients ranged from 0.471 3 to 0.862 1, with an average of 0.629 9; Nei’s gene diversity (He) and Shannon’s information index were 0.379 3 and 0.556 3 at the species level respectively, which proved that the Lonicera japonica varieties had a wide genetic base and a high genetic diversity; The cluster analysis presented that the 23 varieties were divided into three main groups by using the unweighted pair-group method with arithmetic average (UPGMA) based on ISSR molecular marker data. So, the ISSR markers can be effectively used to evaluate the genetic diversity of honeysuckles, thus providing a theoretical foundation for the identification and classification of honeysuckle cultivars, and for the efficient use of their germplasm resources.

∶ Lonicera japonica; genetic variation; genetic relationship; ISSR analysis

S759.3；Q948

A

1673-923X(2013)11-0077-06

2013-05-10

國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“金銀花、厚樸優(yōu)良新品種創(chuàng)制及利用技術(shù)研究”（201104023）

王湘瑩（1989-），女，湖南長(zhǎng)沙人，研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究

何 鋼（1965-），男，湖南湘潭人，教授，碩士，從事生物技術(shù)教學(xué)與科研

[本文編校：謝榮秀]