3種中藥散劑中黃連薄層色譜無苯展開系統(tǒng)研究

朱 弘，陳敏艷，朱育紅

（陜西省獸藥監(jiān)測(cè)所，陜西西安710016）

黃連為毛莨科植物黃連Coptis chinensis、三角葉黃連Coptis deltoidea 或云連Coptis teeta 的干燥根莖，分別習(xí)稱“味連”、“雅連”、“云連”。收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版1 部與《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版2 部，性寒，味苦，主要功能清熱燥濕，瀉火解毒［1－2］。主要活性成分為黃連生物堿，目前，己從黃連中分離出來的生物堿包含有小檗堿（berberine）、黃 連 堿（coptisine）、表 小 檗 堿（epiberberine）、巴馬汀（paimatine）等幾十種［3］。黃連與梔子、黃芩、黃柏等藥材配伍，組成的方劑黃連解毒散、香薷散、烏梅散等常用中獸藥散劑，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)，療效可靠。黃連在這些制劑中多為君藥，該藥材的真假、質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到藥品的療效。因此，黃連的檢驗(yàn)成為控制其質(zhì)量的重要手段。通常檢驗(yàn)黃連采用薄層色譜法的展開系統(tǒng)為苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1），色譜圖中4個(gè)主斑點(diǎn)清晰，分離度好。黃連解毒散、香薷散、烏梅散3種成方制劑的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版2部中，黃連的色譜鑒別也用的是該系統(tǒng)。但此展開系統(tǒng)中含有苯。苯（C6H6）是無色易揮發(fā)液體；沸點(diǎn)80.1 ℃，有芳香氣味，比重0.879，不溶于水，溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。苯的毒性大，對(duì)中樞神經(jīng)及血液影響大，對(duì)人體具有致癌作用。本試驗(yàn)以黃連解毒散、香薷散、烏梅散為對(duì)象，研究了黃連薄層色譜鑒別無苯展開系統(tǒng)，以降低展開試劑中苯對(duì)人體的危害及環(huán)境的污染，同時(shí)為完善黃連薄層色譜鑒別方法提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 黃連解毒散、香薷散、烏梅散樣品（參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版2部在實(shí)驗(yàn)室自制，藥材均購(gòu)自西安市怡康藥店）；黃連對(duì)照藥材（批號(hào)z0010704）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)z0221206，含量為94.5%），中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 CAMAG 薄層色譜儀，Linomat－5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、ADC 2全自動(dòng)展開儀、TLC Visualizer數(shù)碼成像系統(tǒng)，CAMAG 公司產(chǎn)品；BSA2202S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BP211D雙量程電子天平，Sartorius公司產(chǎn)品，KQ－500DE型超聲提取器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；LABOROTA4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道爾夫公司產(chǎn)品；硅膠G 薄層板（thin layer plate）規(guī) 格10 cm×20cm，批 號(hào)20140320，青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要化學(xué)試劑 氧化鋁，西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，苯、乙酸乙酯、甲醇、異丙醇、三氯甲烷等溶劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 黃連解毒散供試品溶液制備 稱取本品粉末1.3g，置100mL具塞錐形瓶中，加甲醇20mL，加熱回流15min，放至室溫，用鋪有濾紙與氧化鋁的濾器濾過，濾液作為供試品溶液1。

1.2.1.2 香薷散供試品溶液制備 稱取本品粉末2g，置100mL具塞錐形瓶中，加甲醇20mL，超聲處理（功率500 W，頻率40kHz）15min，過濾，濾液作為供試品溶液2。

1.2.1.3 烏梅散供試品溶液制備 稱取本品粉末0.5g，置100mL具塞錐形瓶中，加甲醇10mL，加熱回流15min，濾過，濾液濃縮至5mL，作為供試品溶液3。

1.2.1.4 對(duì)照藥材溶液的制備 稱取黃連對(duì)照藥材0.2g，按照黃連解毒散供試品溶液制備方法，制成對(duì)照藥材溶液。

1.2.1.5 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品5mg，加甲醇10mL，制成每毫升含鹽酸小檗堿0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2 4種不同展開系統(tǒng)薄層色譜法試驗(yàn)

1.2.2.1 現(xiàn)行展開系統(tǒng)［苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1）］ 分別吸取對(duì)照品、對(duì)照藥材和供試品1、2、3五種溶液各2μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液（12∶6∶3∶3：1）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。

1.2.2.2 無苯展開系統(tǒng)篩選 ①無苯展開系統(tǒng)1：分別吸取對(duì)照品、對(duì)照藥材和供試品1、2、3五種溶液各2μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－醋酸－水（7∶1∶2）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，置紫外光（365nm）下檢視。②無苯展開系統(tǒng)2：分別吸取對(duì)照品、對(duì)照藥材和供試品1、2、3五種溶液各2μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－氨水（15∶4∶1）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30min展開，取出，晾干，置紫外光（365nm）下檢視。③無苯展開系統(tǒng)3：分別吸取對(duì)照品、對(duì)照藥材和供試品1、2、3五種溶液各2μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30min，展開，取出，晾干，置紫外光（365nm）下檢視。

2 結(jié)果

2.1 采用1.2.2.1方法試驗(yàn)結(jié)果

3種供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯一個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯4個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖1）。

2.2 采用無苯展開系統(tǒng)1試驗(yàn)結(jié)果

3種供試品溶液在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯一個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，但其中兩個(gè)斑點(diǎn)不能完全分離，且斑點(diǎn)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，輪廓不很清晰（圖2）。

圖1 黃連薄層鑒別圖［展開劑：苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1）］Fig.1 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：benzene－ethyl acetate－methanol－isopropanol－concentrated ammonia solution（12∶6∶3∶3∶1）］

圖2 黃連薄層鑒別圖［展開劑：正丁醇－醋酸－水（7∶1∶2）］Fig.2 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：butanol－acetic acid－water（7∶1∶2）］

2.3 采用無苯展開系統(tǒng)2試驗(yàn)結(jié)果

3種供試品溶液在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，雖顯一個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，但與對(duì)照藥材溶液色譜斑點(diǎn)分離度不高，其中兩個(gè)斑點(diǎn)已接近溶劑前沿，Rf值過大（圖3）。

圖3 黃連薄層鑒別圖［展開劑：三氯甲烷－甲醇－氨水（15∶4∶1）］Fig.3 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：chloroform－methanol－ammonia（15∶4∶1）］

2.4 采用無苯展開系統(tǒng)3試驗(yàn)

3種供試品溶液在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯一個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯4個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離度高，清晰可辨（圖4）。

圖4 黃連薄層鑒別圖［展開劑：環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）］Fig.4 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：cyclohexane－ethyl acetate－isopropanol－methanol－watertrimethylamine（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）］

3 討論

薄層色譜法是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的分析方法。在薄層色譜中展開系統(tǒng)是決定薄層色譜分離效果的重要因素。其主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活度和展開劑的極性進(jìn)行選擇，通過組分分子與展開劑分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心而得到分離［4－5］?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》2010年版2部中獸藥成方制劑黃連解毒散、香薷散、烏梅散中黃連薄層色譜鑒別所用展開劑都有苯，由于苯屬一類溶劑，對(duì)人體和環(huán)境的危害很大，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室均已避免使用。2005年版《中國(guó)藥典薄層色譜彩色圖譜集》中已經(jīng)將苯改為甲苯，但該展開系統(tǒng)不穩(wěn)定，存在重現(xiàn)性差的問題［6］。在選擇合適的展開系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)根據(jù)展開系統(tǒng)特性，使被分離混合物全分離，且易進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析［7］。本次在黃連解毒散、香薷散、烏梅散中黃連薄層色譜鑒別無苯展開系統(tǒng)的研究過程中，我們考察了不同展開劑不同比例的配制方法、溶劑用量、展開劑飽和的時(shí)間和樣品不同點(diǎn)樣量，結(jié)果表明，以展開系統(tǒng)3：環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）的分離效果良好，斑點(diǎn)清晰。點(diǎn)樣量1μL，斑點(diǎn)顏色較淡，不甚清晰；點(diǎn)樣量4μL、6μL，則斑點(diǎn)顏色太重，分離不好，有拖尾現(xiàn)象；點(diǎn)樣量2μL，斑點(diǎn)顏色適中，且輪廓清晰，分離度高。該方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)黃連解毒散、香薷散、烏梅散中黃連的真?zhèn)?，有效監(jiān)控藥品質(zhì)量。且展開系統(tǒng)去除了“苯”試劑，降低試劑對(duì)試驗(yàn)操作者的毒害，對(duì)人體的健康和保護(hù)環(huán)境起著積極作用，可為黃連解毒散、香薷散、烏梅散和有關(guān)黃連等其他成方制劑薄層色譜鑒別提供參考。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版1部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，285.

［2］ 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典：2010 年版2 部［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：417.

［3］ 趙 楠，李隆云，白志川.中藥材黃連的研究現(xiàn)狀與展望［J］.重慶理土大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，29（1）：53－58.

［4］ 劉子瑤，孫姝雯，肖海英，等.淺析TLC中新型展開劑的選擇和替代方法［J］.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（1）：222－223.

［5］ 孫 莉，唐 超，冷一平.薄層色譜法新型展開劑的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)西部科技，2010.12，9（36）：47－48.

［6］ 劉和平，王樣紅.黃連薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)與《中國(guó)獸藥典》商榷［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，2009（S）：337－339.

［7］ 劉 紅，劉 華.薄層色譜法分離黃連素、咖啡因時(shí)展開劑的選擇［J］.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005.8，30（4）：378－381.