血吸蟲病抗體檢測試紙條對實驗感染水牛的抗體檢測

陽愛國，周 煜，郭 莉，董國棟，毛光瓊，鄧永強，田慧云，吳云飛， 侯 巍，馬 坤，陳 冬，文 豪，朱銀寶

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041；2.湖北省動物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢430000；3.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明650051；4.四川省廣漢市動物疫病預(yù)防控制中心，四川廣漢618003；5.南京路寶生物科技有限公司，江蘇南京210000）

血吸蟲病是由裂體吸蟲屬血吸蟲引起的一種慢性人畜共患寄生蟲病，主要流行于亞、非、拉美的78個國家和地區(qū)［1］，而我國的血吸蟲病主要由日本血吸蟲引起［2］。日本血吸蟲嚴(yán)重威脅著我國疫區(qū)人們的健康和生命安全，也給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［3］。耕牛是血吸蟲的重要宿主，血吸蟲尾蚴通過感染耕牛，在牛體內(nèi)發(fā)育成熟產(chǎn)出蟲卵，耕牛排出大量糞便的同時也將蟲卵排出到水田、水渠等野外污染水環(huán)境，人們通過動物使役或田間作業(yè)時感染血吸蟲病原［4－5］。因此，耕牛血吸蟲感染率高低在一定程度上決定了當(dāng)?shù)匮x病的流行程度。而使用適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)方法普查血吸蟲病水牛，篩選出治療目標(biāo)群體是低成本控制血吸蟲病疫情的重要手段［6］。

以往，通常采用IHA、Dot－ELISA［7］或膠體金［8］等血清學(xué)技術(shù)對耕牛開展普查工作，但這些方法不同程度存在操作復(fù)雜、效率低、需要一定實驗條件以及穩(wěn)定性低等缺點，用于基層普查篩選工作限制較多［9－13］。而本試驗使用的牛血吸蟲抗體檢測試紙條是利用乳膠微球免疫層析法（DLIA）原理研制的血清免疫學(xué)診斷方法，它是近年從膠體金免疫層析法（GICA）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)［14］。與膠體金相比，乳膠微球是高分子微球，顆粒大（200nm～300 nm）［15］，用紅色乳膠微球代替膠體金作為標(biāo)記物可以用更少的抗體或抗原在幾分鐘內(nèi)就能清晰顯色，判斷結(jié)果；乳膠微球的羧基與兔抗牛IgG 的氨基共價結(jié)合，形成乳膠微球－兔抗牛IgG 結(jié)合物，穩(wěn)定性好，大小均一，制備的試紙條質(zhì)量更可控。血吸蟲在畜體內(nèi)存在尾蚴、童蟲、成蟲、蟲卵四個不同階段，各階段的蟲體及其分泌物均可作為抗原刺激機體產(chǎn)生抗體，然而從刺激到產(chǎn)生抗體需要一定時間；如果動物體內(nèi)的抗原消失，抗體也需要一定時間才能消失［16］。因此，本試驗采用牛血吸蟲抗體檢測試紙條檢測實驗感染血吸蟲水牛治療前后不同時間的抗體水平，明確可檢出的時間極限，為試紙條是否具有早期診斷價值和療效參考價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物及血吸蟲尾蚴 10頭健康耕牛來自血吸蟲病非疫區(qū)，均為水牛，年齡2歲，體重約500kg，經(jīng)糞孵及Dot－ELISA 確診為血吸蟲陰性。試驗水牛隨機編號為1 號～10 號。血吸蟲尾蚴為從疫區(qū)采集的陽性釘螺放逸。

1.1.2 檢測試劑及藥品 牛血吸蟲病抗體檢測試紙條，南京路寶生物科技有限公司產(chǎn)品（批號：20130525）；獸用吡喹酮，南京制藥廠產(chǎn)品（批號：20130121）。

1.2 方法

1.2.1 牛實驗感染血吸蟲 用接種環(huán)挑取血吸蟲尾蚴至于載玻片上，在40倍顯微鏡下觀察計數(shù)。對水牛的背部剃毛，將已計數(shù)的有尾蚴的蓋玻片貼于水牛裸露皮膚處感染5min～10min，每頭水牛接種1 000條尾蚴。

1.2.2 血紙的制備

1.2.2.1 水牛感染血吸蟲前后血紙的制備 在實驗室感染血吸蟲尾蚴前，按照常規(guī)方法制備血紙［17］，作為0周的血紙樣品。水牛感染后第1周～第7周，每頭水牛每周制備一次血紙，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 水牛感染血吸蟲治療后血紙的制備 水牛感染血吸蟲第7周后用吡喹酮進行治療，治療后每隔4周制備一次血紙，直至24周，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實驗感染牛血吸蟲的治療 10頭水牛實驗感染血吸蟲后第7周，使用吡喹酮的治療感染耕牛，使用劑量按0.06g／kg進行，隔7d后再治療一次。

1.2.4 實驗感染血吸蟲水牛治療前后血紙抗體的檢測

1.2.4.1 操作前準(zhǔn)備 試紙條從冰箱取出置室溫平衡1h。

1.2.4.2 操作步驟 將各血紙進行編號，裁剪血紙圓片0.24cm2放在0.4mL 血紙浸泡液中，室溫浸泡30min；取試紙條，將帶箭頭端的試紙條插入已搖勻浸泡好的血紙液中，待液體在NC 膜上滲出0.5 cm 左右時，將試紙條平放在盤中或桌面上，5min～30min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.2.4.3 結(jié)果判定 T、C線均出現(xiàn)紅色帶，判為陽性；僅C 線出現(xiàn)紅色帶，則判為陰性；T、C 線均不出現(xiàn)紅色帶，判為無效。

2 結(jié)果

2.1 實驗感染血吸蟲水牛臨床癥狀的變化

感染血吸蟲尾蚴的水牛在感染后第4周～5周時開始出現(xiàn)明顯的精神沉郁、采食量下降、被毛凌亂、拉稀、消瘦等血吸蟲病癥狀。經(jīng)過藥物治療后展現(xiàn)良好療效，感染牛精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，采食量提高，拉稀停止。

2.2 感染水牛治療前后不同時間血吸蟲抗體的檢出情況

試紙條測定10頭人工接種血吸蟲水牛治療前后的血紙抗體消長規(guī)律結(jié)果顯示，接種前的10頭水牛血紙均為陰性；水牛在接種血吸蟲毛蚴的第4周檢測到6頭水牛血吸蟲抗體呈陽性，即1號、2號、4號、6號、7號和9號水牛，隨后抗體一直遞增，感染水牛第5周10頭水牛抗體全部呈陽性。使用吡喹酮藥物治療后，感染水牛血吸蟲抗體在治療后第16周逐步轉(zhuǎn)為陰性，1號、3號和8號水牛在此時抗體消失；2號、5號、6號和10號水牛在治療后的第20周抗體消失；4號、7號和9號水牛在治療后的第24周抗體消失，至此10頭水牛血吸蟲抗體均為陰性，從圖表可以看出該試紙條具有早期診斷和療效考核價值（表1）。

表1 人工感染血吸蟲水牛治療前后抗體檢測結(jié)果Table 1 The results of anti－schistosome antibody detection in blood paper of experimentally infected buffalo before and after treatment

3 討論

接種血吸蟲尾蚴抗原數(shù)量多少直接關(guān)系到水牛能否成功感染血吸蟲病原，也關(guān)系到水牛產(chǎn)生血吸蟲抗體及治療后抗體消失的時間長短。盧福莊等［18］研究表明，在接種血吸蟲尾蚴200 條／頭～1 100條／頭的范圍內(nèi)，血吸蟲抗體可達到的最高水平，治療后抗體轉(zhuǎn)陰時間與接種尾蚴的數(shù)量之間似乎沒有一定的規(guī)律，故本試驗選擇1 000條血吸蟲尾蚴進行接種能很好的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體。從檢測結(jié)果來看，接種后第4周血吸蟲抗體陽性數(shù)為6頭，陽性率為60%，直到第5周抗體陽性率才為100%；治療后第16周，血吸蟲抗體陰性有3頭，陰性率為30%，直到第24 周時才全部轉(zhuǎn)陰。雖然都接種1 000條血吸蟲尾蚴，但10頭感染的水牛并沒有在第4周同時產(chǎn)生陽性反應(yīng)，治療后10頭水牛也沒有在第16周抗體同時轉(zhuǎn)為陰性，感染后抗體的產(chǎn)生和治療后抗體的消失10頭水牛需要的時間并不一致。這是由于雖然相同數(shù)量的抗原刺激動物機體，但由于不同水牛之間的免疫系統(tǒng)發(fā)育水平各有差異，導(dǎo)致抗原刺激機體后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時間和強度不同，從而使抗體產(chǎn)生和消失的時間有所差異。

目前，國內(nèi)外尚無用乳膠微球免疫滲濾法檢測血紙抗體的試紙條來研究家畜血吸蟲抗體消長水平的相關(guān)研究。張雪娟等［19］用Dot－ELISA 方法研究牛實驗感染血吸蟲前后及治療后抗體的動態(tài)變化曲線，該方法可在感染后1周～2 周檢測出血吸蟲抗體，并在治療后31周～42周抗體消失。李友等［20］以血吸蟲重組融合蛋白（rLHD－Sj23－GST）間接ELISA 法檢測牛感染血吸蟲的血清抗體，結(jié)果表明，在感染后5周～8周（多數(shù)在7周～8 周）抗體呈陽性，感染后18周～34周轉(zhuǎn)陰。趙清蘭等［21］用重組LHD－Sj23蛋白乳膠凝集試驗（檢測IgM）檢測實驗感染血吸蟲牛血清，感染后第3周可以檢測出抗體，治療后第13周抗體開始轉(zhuǎn)陰，但沒有明確最遲轉(zhuǎn)陰的時間是多少。盧福莊等［18］利用金標(biāo)免疫滲濾法研究牛、兔實驗室感染血吸蟲治療前后抗體的消長規(guī)律，結(jié)果表明，金標(biāo)免疫滲濾法可在牛感染后2周～4周內(nèi)檢測出血吸蟲抗體，治療后27周～39周抗體消失。因此，推測本試紙條的敏感性優(yōu)于rLHD－Sj23－GST 間接ELISA 法和LHD－Sj23蛋白乳膠凝集試驗，低于Dot－ELISA 法和金標(biāo)免疫滲濾法。本試驗成功反映了人工接種血吸蟲尾蚴水牛抗體水平的消長規(guī)律，指示牛血吸蟲血紙抗體檢測試紙條在血吸蟲抗體檢測的臨床意義，用該試紙條判斷水牛是否感染了血吸蟲病最好在間隔5周的時間連續(xù)檢測2次；用于治療藥物的療效考核應(yīng)在患血吸蟲病水牛治療6個月后進行較為妥當(dāng)。

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