青海省某奶牛場(chǎng)頑固性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性研究

林 杰，王旭榮，楊志強(qiáng)，王 磊，張景艷，孔曉軍，王學(xué)智，秦 哲，王孝武，李建喜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

目前奶牛乳房炎仍然是制約奶牛產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國家奶牛產(chǎn)業(yè)體系疾病控制研究室2011年至2014年的臨床調(diào)查結(jié)果顯示，因頑固性乳房炎淘汰的病牛占疾病淘汰病牛的40%～65%。引起奶牛乳房炎發(fā)生的病因很多，但病原菌仍然是最重要的原因之一，以鏈球菌屬、葡萄球菌屬和腸桿菌屬為主，但是，不同地區(qū)病原菌種屬之間也存在一定差異，需要結(jié)合病原菌分型進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)隨著奶牛養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，致病菌的類型和優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生了一定變化，增加了奶牛乳房炎的防治難度。

2014年6月青海省某奶牛場(chǎng)出現(xiàn)多頭頑固性乳房炎的病例，為了明確此次引起奶牛乳房炎的病原菌，并制定確實(shí)有效的防控方案。本課題組無菌采集15份病牛乳樣，進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、病原菌分型和藥物敏感性試驗(yàn)。具體分析和結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2014年6月青海省某奶牛場(chǎng)出現(xiàn)多頭頑固性乳房炎的病例，久治不愈。主要臨床表現(xiàn)為奶牛乳區(qū)紅腫，觸感硬實(shí)，每頭病牛的乳區(qū)均出現(xiàn)不同程度的萎縮，有的乳區(qū)萎縮嚴(yán)重；乳樣主要呈絮狀、凝塊或濃稠的奶油狀，個(gè)別乳樣為水樣泛黃，部分奶樣為血乳。隨機(jī)選擇部分頑固性乳房炎病牛，對(duì)患病乳區(qū)分別采集乳樣，共采集15份病牛乳樣。具體采集方法如下：先用溫水清洗乳房，然后依次用新潔爾滅、750mL／L酒精消毒乳頭。每個(gè)乳頭棄去初始2 把～3 把奶，后以無菌操作方法分別采集每個(gè)乳室的乳樣于乳樣采集管中，做好標(biāo)記，加入生物冰袋使乳樣溫度保持在2 ℃～15 ℃冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯、血瓊脂營養(yǎng)基礎(chǔ)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；革蘭染液，南京建成科技有限公司產(chǎn)品；Bacterial DNA Kit，OMEGA BIOTEK 公 司 產(chǎn) 品；16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化鑒定管（兔血漿），青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏紙片 青霉素G（10 單位／片）、頭孢氨芐（30μg／片）、阿 米 卡 星（30μg／片）、卡 那 霉 素（30 μg／片）、四環(huán)素（30μg／片）、強(qiáng)力霉素（30μg／片）、紅霉素（15μg／片）、諾 氟 沙 星（10μg／片）、氧 氟 沙 星（5μg／片）、環(huán) 丙 沙 星（5μg／片）、新 生 霉 素（30μg／片）、復(fù)方新諾明（23.75／1.225／片）、呋喃妥因（300 μg／片）、氯霉素（30μg／片）、頭孢噻吩（30μg／片）、甲氧芐啶（5μg／片）、恩諾沙星（5μg／片），杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 將待檢乳樣搖勻，無菌操作，用接種環(huán)取2 環(huán)～3 環(huán)乳汁樣品間斷劃線接種于血瓊脂平板上，分別在有氧、厭氧2 種培養(yǎng)條件下，37 ℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，觀察細(xì)菌生長情況。對(duì)培養(yǎng)18h～24h 無細(xì)菌生長的血瓊脂平板接種乳，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。挑取細(xì)菌菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢。挑取典型單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，細(xì)菌純化后保存?zhèn)溆?，進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 鑒定方法 采取本實(shí)驗(yàn)室建立的奶牛乳房炎乳汁中病原菌分離鑒定程序進(jìn)行鑒定，其中葡萄球菌屬采用細(xì)菌形態(tài)觀察、革蘭染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)和16SrDNA 序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定；非鏈球菌屬的其他革蘭陽性菌采用細(xì)菌形態(tài)觀察、革蘭染色鏡檢和16SrDNA 序列檢測(cè)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 16SrDNA 序列分析 按照試劑盒操作說明提取被檢細(xì)菌的DNA 并以此DNA 為模板，用16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的Forward Primer和Reverse Primer擴(kuò)增16SrDNA 片段，而后進(jìn)行核酸凝膠電泳。擴(kuò)增片段由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，通過NCBI（http：／／ncbi.nlm.nih.gov／）的在線Blast軟件對(duì)獲取的序列進(jìn)行搜索比對(duì)，并確定細(xì)菌種屬。

1.2.4 金黃色葡萄球菌莢膜多糖分型 金黃色葡萄球菌分型參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行，莢膜多糖5型擴(kuò)增基因片段長度為361bp，莢膜多糖8型擴(kuò)增的基因片段長度為173bp。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參考《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2013》，采用Kirby－Bauer（K－B）紙片擴(kuò)散法，測(cè)定分離菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。每株菌3個(gè)重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取3個(gè)重復(fù)的平均值。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI，2013）推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，通過抑菌圈直徑大小判定病原菌對(duì)藥物的敏感性，分為耐藥（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

被檢乳樣15份，其中6份乳樣檢出細(xì)菌，細(xì)菌檢出率40%。分離得到13株細(xì)菌，其中10株細(xì)菌菌落表面光滑，圓形凸起，周圍有溶血圈，革蘭陽性菌，排列成葡萄狀，血漿凝固酶陽性，疑是金黃色葡萄球菌，編號(hào)為S1～S10；1株血漿凝固酶陰性葡萄球菌編號(hào)為CNS1；2株多形態(tài)的革蘭陽性桿菌，編號(hào)為A1、A2（表1）。

2.2 16SrDNA 序列分析結(jié)果

以提取的細(xì)菌DNA 為模板，用16SrDNA 細(xì)菌鑒定PCR 試劑盒擴(kuò)增16SrDNA 片段，片段長度500bp左右（圖1）。獲得片段序列在GenBank中進(jìn)行Blast搜索比對(duì)，菌株S1～S10 均與金黃色葡萄球菌（基因登錄號(hào)為CP006838.1、CP006630.1、CP007447.1、AB681718.1、KF999668.1、CP007659.1、CP007539.1、CP003045.1）的16SrDNA 同源性為99%以上，故分離株S1～S10的鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌；CNS1 與表皮葡萄球菌（基因登錄號(hào)為AY030342.1）的16SrDNA 同源性為99%以上，確定CNS1 為表皮葡萄球菌；A1、A2均與化膿隱秘桿菌（基因登錄號(hào)為GU372928、NR121796.1）16SrDNA 同源性為99%以上，故A1、A2鑒定為化膿隱秘桿菌（表1）。

2.3 金黃色葡萄球菌莢膜多糖分型結(jié)果

參照文獻(xiàn)，以分離菌株S1～S10 的細(xì)菌DNA為模板，進(jìn)行莢膜多糖基因擴(kuò)增，所分離金黃色葡萄球菌均擴(kuò)增出361bp的片段（圖2），故分離株金黃色葡萄球菌S1～S10均為莢膜多糖5型。

圖1 分離菌的16SrDNA PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR products of 16SrDNA of isolates

表1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Table 1 Isolation and identification of bacteria

圖2 S1～S10金黃色葡萄球菌莢膜多糖基因PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR products of capsular polysaccharides of S.aureus S1－S10isolates

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌對(duì)阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟哌酸、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、新生霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢噻吩、甲氧芐氨嘧啶和恩諾沙星均敏感，而對(duì)青霉素G、紅霉素、頭孢氨芐和呋喃妥因耐藥率分別為100%、90%、10%和10%（圖3）；表皮葡萄球菌對(duì)青霉素G、復(fù)方新諾明和甲氧芐氨嘧啶耐藥，而對(duì)其他14種抗菌藥物敏感；化膿隱秘桿菌對(duì)四環(huán)素和甲氧芐氨嘧啶耐藥，對(duì)強(qiáng)力霉素和復(fù)方新諾明中度敏感，對(duì)其他13種抗菌藥物敏感。

圖3 金黃色葡萄球菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity tests of Staphylococcus aureus to antimicrobials

3 討論

此次青海省某奶牛場(chǎng)發(fā)生頑固性乳房炎，久治不愈，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析，是由金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌、表皮葡萄球菌混合感染造成的。此次發(fā)病較為嚴(yán)重，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，乳樣的細(xì)菌檢出率為40%，結(jié)合臨床現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，筆者認(rèn)為此次細(xì)菌檢出率低是因?yàn)榛疾『笈?chǎng)已多次使用抗菌藥物治療，治療效果不佳才進(jìn)行樣品檢測(cè)，而一般進(jìn)行乳房炎的病原檢測(cè)，采樣是在治療前進(jìn)行的，由于抗菌藥物的使用造成細(xì)菌分離難度加大甚至分離不到。此次分離到的細(xì)菌以莢膜多糖5型金黃色葡萄球菌為主要病原。有研究表明，金黃色葡萄球菌引起的乳房炎多為慢性病例而且容易復(fù)發(fā)，難以自愈［2］，而且由于金黃色葡萄球菌感染時(shí)間長，未及時(shí)治愈，巨噬細(xì)胞在乳腺部位對(duì)抗病原菌會(huì)逐漸引起乳腺組織的纖維化并使乳腺喪失泌乳功能，此次病例中乳區(qū)出現(xiàn)硬實(shí)、乳腺萎縮臨床癥狀可能與金黃色葡萄球菌感染時(shí)間長有關(guān)。本次采集的乳樣有血乳，推測(cè)是與分離的化膿隱秘桿菌有關(guān)，化膿隱秘桿菌可以產(chǎn)生外毒素PLO，能夠溶解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞［3］。此外乳樣中分離出表皮葡萄球菌，可能與該牛場(chǎng)乳房炎病例久治不愈有關(guān)，作為凝固酶陰性葡萄球菌，屬條件致病菌，可作為耐藥基因的儲(chǔ)藏場(chǎng)所，形成生物被膜和毒力因子，引起的奶牛乳房炎反復(fù)發(fā)作難以治愈［4］，大量報(bào)道也證實(shí)了凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性問題已經(jīng)不容忽視［5－8］。

有研究表明金黃色葡萄球菌具有高度異質(zhì)性［9］，且 分 型 復(fù) 雜，有 多 種 分 型 方 法［10－11］，莢 膜 多 糖是金黃色葡萄球菌的主要致病因子之一，所以莢膜多糖分型是主要的分型方法之一。本試驗(yàn)采用PCR方法確定此次分離的10株金黃色葡萄球菌均為莢膜多糖5型。而郭宇等對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)9個(gè)牛場(chǎng)的乳房炎病原菌進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造成奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌以莢膜多糖8型為主（72.41%）［12］；王登峰等［13］研究發(fā)現(xiàn)新疆部分地區(qū)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌以336型為主（64.96%）；莢膜多糖5型和8型分別占10.26%和13.68%。張燕等［14］研究來自四川、山東、湖北、陜西和上海等地共462 株人源金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)莢膜多糖8 型為主占70.9%。Verdier I等［1］對(duì)從多國收集的195 株人源金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，結(jié)果為莢膜多糖5型占42%，8型占45%由此可見，金黃色葡萄球菌莢膜多糖優(yōu)勢(shì)型別在不同地域和不同物種之間的分布有一定差異。金黃色葡萄球菌的分型研究可為該病原的流行病學(xué)提供數(shù)據(jù)，為其致病機(jī)制和疫苗研制奠定基礎(chǔ)［15］。

化膿隱秘桿菌是奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一［16－17］。但目前關(guān)于該菌引起乳房炎的報(bào)道和研究較少。此次從頑固性乳房炎病例樣品中分離出化膿隱秘桿菌，筆者推測(cè)可能與該奶牛場(chǎng)奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生有一定關(guān)系，因?yàn)閺哪膛?chǎng)的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該場(chǎng)子宮內(nèi)膜炎的病例較多，而且治療效果一般，通過細(xì)菌分離鑒定分析發(fā)現(xiàn)，化膿隱秘桿菌是造成該場(chǎng)子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一，該結(jié)果在另文中報(bào)道。

此次頑固性乳房炎是由3種病原菌混合感染造成的，而且與子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生有一定的相關(guān)性，結(jié)合牛場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生管理調(diào)查，建議該場(chǎng)加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理工作。而且此次分離的病原菌的藥物敏感性不同，故而治療困難，后建議使用恩諾沙星治療病牛并加強(qiáng)隱性乳房炎的篩查與防治，病情得到了控制。

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