花椒精油對HaCaT 細胞增殖和凋亡的影響

周 瑞，楊文化，李科友

（西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100）

銀屑病是一種免疫調(diào)節(jié)的慢性炎癥性皮膚疾病，全世界人群發(fā)病率約為2%～3%，亞洲成人染病率較低，低于0.1%［1］。同時，有證據(jù)表明中重度銀屑病病人患心血管疾病、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等疾病的幾率相對較高［2］。目前對于銀屑病的治療方式包括傳統(tǒng)治療、光線療法、維生素A 等，盡管這些方法對于抑制銀屑病病癥有一定效果，但是許多藥物都具有嚴重的副作用，且長期用藥會引起銀屑病藥物耐受性?，F(xiàn)已知在銀屑病發(fā)生和發(fā)展中，角化細胞起到至關(guān)重要的作用。因此，抑制角化細胞過度增殖，誘導其發(fā)生凋亡，對于治療銀屑病具有重要的作用，長久以來也被作為銀屑病治療的靶向目標［3］。

在我國，中草藥已被廣泛用于銀屑病的治療，已經(jīng)過臨床試驗，并證明有一定的療效［4］?；ń肥且环N來源較廣的木本植物，主要種植在我國陜西、青海和甘肅等省，其果皮主要用作辛辣調(diào)味品和作料［5］?！侗静菥V目》中亦有記載，花椒是一種傳統(tǒng)的中草藥，可用于治療嘔吐、風邪、牙痛、腹痛、濕疹和腹瀉等疾?。?－7］。此外，有文獻報道花椒精油具有抗腫瘤［8］、抗炎［9］以及抗菌［10］等功效。近年來，從植物中獲得的精油作為處理一些皮膚問題的配方中的活性成分得到了研究者的高度關(guān)注［11］。

尚未見到花椒精油抗銀屑病活性方面的報道，本研究選取體外研究銀屑病相關(guān)試驗的模式細胞HaCaT 細胞作為研究對象，研究花椒精油對其增殖抑制的影響以及誘導凋亡效應及的內(nèi)在機制，為更好地了解銀屑病致病機理提供理論基礎(chǔ)，也為該類疾病提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HaCaT 細胞購于中科院昆明動物研究所；前列腺癌細胞株（PC－3）、人喉癌上皮細胞株（HEp－2）、宮頸癌細胞株（Hela）以及人乳腺癌細胞株（MCF－7）由西北農(nóng)林科技大學雷鳴教授饋贈；花椒果皮（陜西鳳縣大紅袍）采購自陜西楊凌；花椒精油經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取并保存于－20 ℃?zhèn)溆茫籘ween－80 購于MP Biomedicals公司；DMEM 培養(yǎng)液、RPMI－1640培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibico公司；胰蛋白酶、臺盼藍染液、SRB 購自英國Sigma Aldrich公司；100×青霉素及鏈霉素溶液、40mL／L多 聚 甲 醛 溶 液、Caspase－8、Caspase－9、Caspase－3、PARP、Bcl－2、Bax、β－actin抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購買于碧云天公司；凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；硝酸纖維素膜和ECL發(fā)光液購自Bio－Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取 將干燥的花椒果皮研磨成粉，過50目篩。每100g粉末加雙蒸水1L 于圓底燒瓶中，利用油水分離器蒸餾提取3h 制備精油。制備的精油用無水硫酸鈉干燥后0.22μm 微膜過濾，置－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)與處理 HaCaT 細胞作為體外模式細胞，已廣泛用于抗銀屑病藥物研究。HaCaT、HEp－2、Hela、MCF－7 細 胞 培 養(yǎng) 于DMEM 培 養(yǎng) 基中，PC－3 細 胞 于RPMI－1640 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)。所 有培養(yǎng)基中添加100mL／L 的FBS和抗生素，在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換。待細胞融合達70%～80%，不同含量精油處理進行試驗分析?；ń肪筒捎锰砑覶ween－80的DMEM 培養(yǎng)液助溶，Tween－80終含量不超過0.1mL／L，保證對細胞無毒性。

1.2.3 形態(tài)學觀察 HaCaT 細胞接種至6 孔板，待貼壁后，用不同含量精油（0.1、0.25、0.5mL／L）處理24h，Tween－80 作為陰性對照。倒置顯微鏡（Leica，Germany）觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.4 細胞毒性與生長曲線測定HaCaT 細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，培養(yǎng)至貼壁。加入不同含量（0.05、0.1、0.25、0.5、1、2mL／L）花椒精油，每個含量3 孔重復，分別處理24、48、72h，Tween 80作為陰性對照。達到處理時間后，取出培養(yǎng)板，每孔加入100mL／L 冰三氯乙酸（TCA），4 ℃放置1h。去離子水洗滌5次后并自然風干后，加入4g／L的SRB 溶液，室溫避光處染色30 min。10 mL／L冰醋酸洗滌5次后自然風干。給SRB染色的細胞中加入10mmol／L 的Tris－base溶解蛋白并用多功能酶標儀測定540nm 處吸光值（OD）。細胞生長抑制率（%）＝［（對照組OD 平均值－試驗組OD平均值）／對照組OD 平均值］×100%計算生長抑制率。應用SPSS 19.0軟件分析計算IC50。為了測定HaCaT 細胞生長曲線，將細胞以每孔5×104個種在24孔板中，培養(yǎng)至貼壁后用不同含量精油（0.1、0.25、0.5mL／L）處理。小心將細胞用胰酶消化并加入，并取適量細胞懸液加入臺盼藍染色。利用細胞計數(shù)器每24h計數(shù)1次，持續(xù)6d。根據(jù)細胞數(shù)變化利用Sigma plot 10.0 軟件繪制生長曲線。

1.2.5 細胞周期試驗 細胞在添加不同含量精油（0.1、0.25、0.5 mL／L）的6 孔 板 中 培 養(yǎng)24 h，Tween 80 作為陰性對照。離心收集細胞后用700 mL／L冰乙醇溫和混勻，4 ℃過夜。用冰的PBS 溶液洗兩次，并用5μL RNase 37℃水浴處理30min，隨后加入400μL 碘化丙啶（PI）4 ℃染色處理30 min。染色完成后，利用流式細胞儀分析細胞周期，數(shù)據(jù)采用Flow JO 7.6.5軟件進行分析。

1.2.6 AnnexinV－PI雙染色和細胞凋亡試驗HaCaT 細胞在添加不同含量精油（0.1、0.25、0.5 mL／L）的6孔板中培養(yǎng)24h，Tween 80作為陰性對照。細胞離心收集后用緩沖液進行重懸浮后，添加FITC 和PI室溫避光反應15min。采用流式細胞儀進行分析，利用FlowJO 7.6.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 Western blot試驗 利用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況。HaCaT 細胞用不同含量精油（0.1、0.25、0.5mL／L）處理24h后，離心收集細胞后，用含有0.5 mmol／L 苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白酶抑制劑（PI）混合物的裂解液裂解細胞，BCA 法進行蛋白定量。相同劑量的蛋白樣品進行120mL／L 的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用50g／L 脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST 緩沖液洗膜，各自加入到相應的β－actin、Bcl－2、Bax、PARP、Caspased－8、Caspased－9、Caspased－3一抗中（1∶1 000），4 ℃過夜。TBST洗膜后，加入50g／L脫脂牛奶稀釋至1∶2 000的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗室溫孵育1h。向膜上滴加ECL發(fā)光液后，Bio－Rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像分析，用β－actin作蛋白上樣量標準對照。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)來自至少3次相近結(jié)果的獨立試驗，以平均值±標準差形（ˉx±SD）式表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學差異采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學變化

與對照組相比，低含量精油（0.1 mL／L）處理后，細胞密度和形態(tài)學沒有明顯變化。用0.25 mL／L或0.5mL／L精油處理后，HaCaT 細胞密度急劇降低，細胞出現(xiàn)皺縮，胞間粘連消失現(xiàn)象，表明花椒精油能誘導細胞形態(tài)發(fā)生變化（圖1）。

2.2 花椒精油抑制HaCaT 細胞增殖

為了進一步檢測精油對HaCaT 細胞增殖的影響，通過SRB試驗測定精油對細胞的增殖抑制率?；ń肪蛯τ贖aCaT 細胞毒性作用試驗結(jié)果如圖2A 所示。不同含量花椒精油處理24h 后，活細胞分別減少至95.3%、86.49%、68.38%、31.06%、6.51%、5.89%。作 用HaCaT 細 胞48h 的 精 油IC50值為199.2μg／mL（0.24mL／L）（圖2B），臺盼藍染色試驗表明，0.25 mL／L 和0.5 mL／L 的花椒精油作用細胞后，HaCaT 細胞活力顯著降低。上述結(jié)果表明，花椒精油能顯著抑制HaCaT 細胞增殖，其抑制效應呈現(xiàn)時間－劑量依賴型。同時，花椒精油被證實能有效抑制腫瘤細胞增殖。因此，試驗比較了花椒精油對于四種癌細胞系（PC－3、HEp－2、Hela、MCF－7細胞系）的抑制率（圖2C），花椒精油對上述癌細胞均具有抗性，同時，花椒精油對HEp－2抑制效果 較 為 明 顯，其IC50為174.3 μg／mL（0.21 mL／L）相 對 較 低?；?椒 精 油 作 用 于 MCF－7 和HaCaT 細胞后的制率最為相近，IC50分別為190.9 μg／mL（0.23mL／L）和199.2μg／mL（0.24 mL／L）。花椒精油作用于不同細胞株系的IC50見表1。以上結(jié)果共同表明花椒精油是具有抑制HaCaT 細胞和其他癌細胞增殖的活性。

圖1 花椒精油處理后的HaCaT 細胞形態(tài)學變化（200×）Fig.1 The morphology changes of HaCaT cells treated with ZBEO（200×）

表1 花椒精油作用于HaCaT 細胞以及PC－3、HEp－2、Hela、MFC－7細胞48h的IC50值比較Table 1 Comparison of the IC50values of ZBEO on cultured HaCaT，PC－3，HEp－2，Hela，and MFC－7cells for 48h

2.3 花椒精油對HaCaT 細胞周期的影響

為檢測花椒精油對HaCaT 細胞細胞周期的影響，本試驗采用流式細胞儀分析細胞周期分布，研究花椒精油對HaCaT 細胞周期轉(zhuǎn)換的影響（圖3），陰性對照組在G0／G1期、S期和G2／M 期細胞比例分別為46.67%、34.48%、18.85%。0.1 mL／L 精油處理后，S期細胞增加至37.67%，同時伴隨G0／G1期細胞減少至41.87%。陰性對照與0.1mL／L 精油處理細胞周期變化并無顯著性差異（P＞0.05）。精油含量升高至0.25 mL／L，S期細胞數(shù)顯著增加至41.73%（P＜0.05），伴隨G2／M 期細胞減少至15.92%。然 而，0.5 mL／L 精 油 處 理 后，只 有40.80%的HaCaT 細胞都停滯在S期。上述結(jié)果顯示花椒精油能誘導HaCaT 細胞周期停滯在S期，該誘導效應具有劑量依賴性。

圖2 花椒精油對HaCaT 細胞以及癌細胞的抗增殖活性Fig.2 Anti－proliferative activity of ZBEO on cultured HaCaT and different cancer cell lines

2.4 花椒精油誘導HaCaT 細胞凋亡

為進一步檢測不同含量精油處理后HaCaT 細胞凋亡發(fā)生情況，采用AnnexinV 和PI雙染色法分析不同凋亡狀態(tài)細胞數(shù)目百分比（圖4A 和圖4B），陰性對照和低含量精油（0.1mL／L）處理后，大部分細胞未發(fā)生凋亡現(xiàn)象。然而，當精油含量升高至0.25mL／L和0.5 mL／L 時，凋亡細胞數(shù)目分別劇增至18.54%（P＜0.01）和32.28%（P＜0.01），活細胞數(shù)目分別減少到78.9%和50.51%。陰性對照和0.25mL／L精油處理后，壞死細胞百分數(shù)沒有明顯差別（P＞0.05）。然而，0.5mL／L 精油處理組中壞死細胞百分比增加至17.22%，具有顯著性差異（P＜0.01）。以上結(jié)果明確表明，花椒精油可誘導HaCaT 細胞發(fā)生凋亡，且凋亡效應具有劑量依賴性。

圖3 花椒精油誘導HaCaT 細胞發(fā)生細胞周期停滯Fig.3 ZBEO induced cell cycle arrest in HaCaT cells

圖4 花椒精油誘導HaCaT 細胞發(fā)生細胞凋亡Fig.4 ZBEO induced apoptosis on HaCaT cells

圖5 花椒精油誘導HaCaT 細胞發(fā)生凋亡的模式機理圖Fig.5 Schematic diagram of hypothetic mechanisms underlying ZBEO induction of apoptosis in HaCaT cells

在細胞凋亡過程中，Caspase蛋白家族和Bcl－2蛋白家族分別在內(nèi)源途徑與外源途徑發(fā)揮重要作用。為了進一步研究凋亡中涉及的信號通路，采用Western blot 試驗分析經(jīng)花椒精油處理后的HaCaT 細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。花椒精油作用細胞后可誘導Caspase－8／9／3 發(fā)生剪切，且為濃度依賴型（圖4C）。此外，細胞凋亡過程中，Caspase－3的一個重要的底物PARP 同樣發(fā)生了剪切。從細胞水平來說，細胞凋亡受眾多因素調(diào)控，線粒體膜功能紊亂也可以導致凋亡性細胞死亡。Bcl－2蛋白家族中Bax和Bcl－2蛋白表達水平的擾亂也是引發(fā)細胞凋亡的一個重要因素［12］。花椒精油作用HaCaT 細胞后，Bax和Bcl－2蛋白的表達情況如圖4D 所示。結(jié)果顯示，花椒精油顯著減少HaCaT細胞中抗凋亡蛋白Bcl－2 的表達量，同時使促凋亡蛋白Bax 表達量升高。綜上，花椒精油可誘導HaCaT 細胞發(fā)生凋亡，其潛在機制可能是通過內(nèi)源途徑與外源途徑來共同調(diào)節(jié)的。

3 討論

銀屑病被普遍認為是一種免疫調(diào)節(jié)的慢性炎癥性皮膚疾病，其準確的病因和發(fā)病機理仍不清楚。由于現(xiàn)今的一些可選用的治療方法與藥物都存在如效率不高以及出現(xiàn)耐藥性的缺點，所以對于新的治療方法的研究仍需不懈地努力。在中國，花椒果皮常被用來作為一種調(diào)味品使用，同時也是一種傳統(tǒng)中藥被用于治療嘔吐、牙痛以及胃痛。最近，由于花椒精油在很多疾病中的潛在作用已備受關(guān)注。本研究以HaCaT 細胞為載體，進行了花椒精油對HaCaT 細胞增殖的影響以及在其誘導下HaCaT 細胞發(fā)生凋亡的潛在機制的研究。

SRB試驗結(jié)果說明花椒精油擁有明顯抑制HaCaT 細胞增殖的作用，同時伴有時間和劑量依賴性，IC50為199.2μg／mL（0.24 mL／L）?；ń肪捅徽J為具有潛在的抗癌活性，因此對于花椒精油的抗癌活性也進行了檢測。結(jié)果表明，0.25mL／L 的花椒精油之作用細胞后，4種癌細胞株的活力均有顯著的下降。相比其他細胞株，HEp－2細胞受到的抑制最為明顯，IC50僅174.3μg／mL（0.21mL／L）。此結(jié)果表明，花椒精油對于癌細胞同樣具有一定的抗增殖作用，另一方面也說明了在相同的外界作用條件下不同細胞會出現(xiàn)不同的應激反應。

細胞周期檢查點是一種生化途徑，可確保如DNA 復制、染色體分離等關(guān)鍵事件的有序及時進展以及完成［13］。已有報道證明細胞周期的停滯可能會誘導凋亡［14］。因此，對于發(fā)展新的疾病治療方法，阻滯細胞周期被認為是一種有效的策略。此研究中，流式細胞儀結(jié)果顯示花椒精油可誘導HaCaT細胞在S期受到阻滯，同時伴隨G0／G1期細胞的減少，同時抑制作用具有劑量依賴性。此結(jié)果表明花椒精油對HaCaT 細胞的增殖抑制影響可能是通過阻滯細胞于S期，進而導致細胞發(fā)生凋亡。

深入地了解抗銀屑病藥物誘導凋亡的潛在機制對于加快開發(fā)有效的銀屑病治療策略有著重要意義。一般認為細胞的生長抑制可能是由細胞凋亡或細胞壞死導致，同時細胞凋亡的不充分被認為在銀屑病的發(fā)病機理中有著重要的作用［15］。細胞凋亡又稱程序性死亡，是細胞自毀的一種有效的生理過程，和細胞壞死有著明顯的區(qū)別，不伴隨有炎癥反應。一般來說，細胞凋亡受調(diào)節(jié)于內(nèi)源和外源兩個主要途徑。其中Caspase－9和Caspase－8首先被激活，然后誘導激活效應蛋白Caspase－3。在細胞凋亡中，Caspase－3是一個重要的執(zhí)行蛋白，被激活后的Caspase－3剪切其底物PARP 蛋白，進而引起細胞凋亡［15］。線粒體途徑可被Bcl－2 家族蛋白緊密調(diào)節(jié)［17］，這些蛋白在細胞凋亡中有著重要的作用，包括促凋亡蛋白Bax以及抑凋亡蛋白Bcl－2。在正常細胞中，這兩種蛋白的存在一個適當?shù)钠胶猓ㄟ^整合不同的細胞死亡與存活信號以此來控制細胞的命運［18］。在已有的文獻中報道花椒精油可誘導癌細胞發(fā)生凋亡，但對于HaCaT 細胞的研究還未出現(xiàn)報道。為了研究花椒精油誘導HaCaT 細胞發(fā)生凋亡的情況以及其潛在機制，本研究首先利用流式細胞儀檢測了花椒精油作用后HaCaT 細胞發(fā)生細胞凋亡的比率，結(jié)果顯示隨著花椒精油含量的升高細胞凋亡比率也隨之增加。為了進一步探究其潛在機制，利用Western blot方法分析了Caspase家族和Bcl－2家族中的關(guān)鍵蛋白在花椒精油作用后的HaCaT 細胞中的表達情況。結(jié)果表明HaCaT 細胞經(jīng)不同含量花椒精油處理24h后，procaspase－8／9／3蛋白表達逐漸降低，Caspase－8／9／3蛋白表達逐漸增高，同時PARP 蛋白也發(fā)生了切割。此外，花椒精油可調(diào)節(jié)HaCaT 細胞增加Bax蛋白表達，減少Bcl－2 蛋白表達。上述結(jié)果表明花椒精油誘導HaCaT 細胞發(fā)生的細胞凋亡受到了內(nèi)源以及外源途徑的共同調(diào)節(jié)。

綜上，此研究表明經(jīng)水蒸氣蒸餾法從花椒果皮中提取的精油具有顯著抑制HaCaT 細胞增殖和改變細胞周期轉(zhuǎn)換的活性，同時可通過內(nèi)源途徑和外源途徑共同調(diào)控相關(guān)蛋白表達來誘導HaCaT 細胞發(fā)生凋亡。由于花椒精油抑制HaCaT 細胞增殖與細胞凋亡的誘發(fā)有著密切關(guān)聯(lián)，依據(jù)試驗結(jié)果，本研究假設(shè)了其模式機理圖，如圖5所示。因此，通過研究花椒精油對HaCaT 細胞的增殖抑制情況以及對其誘導HaCaT 細胞發(fā)生細胞凋亡潛在機制的初步探索，進而為更好地了解銀屑病致病機理提供理論基礎(chǔ)，也為該類疾病提供新的治療方法。

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