朱砂七多糖對雛雞十二指腸組織形態(tài)的影響

安 樂，王 娜，劉美琴，高紅霞，牟素菁，郭浩杰，劉建新，張為民，卿素珠

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

近年來，針對中藥多糖的免疫藥理學(xué)研究成為熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)，其具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗輻射、抗衰老及抗寄生蟲等多種生物活性，對促進(jìn)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫都有廣泛的影響；同時(shí)，多糖為天然產(chǎn)物，具有毒副作用小、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而應(yīng)用前景廣闊。中藥多糖作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可以激活T／B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)抗體的生成，激活補(bǔ)體系統(tǒng)等［1］。多糖除了具有上述生物活性外，研究表明，有些植物多糖如蘆薈多糖、大棗多糖及人參莖葉多糖等還可促進(jìn)動(dòng)物腸道的發(fā)育［2－4］。

朱砂七為蓼科植物Polygonum cillinerve（Nakai）Ohwl的塊根，屬于“太白七藥”之一，因其具有顯著的止血止瀉、清熱解毒和去風(fēng)濕等功效而為民間常用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其含有大黃素、大黃素葡萄糖苷和大黃素甲醚等蒽醌類物質(zhì)。研究表明，朱砂七水浸液對多種腸道及呼吸道病毒有較好的廣譜抗病毒功能；通過直接殺滅和抑制單純皰疹病毒對細(xì)胞的吸附、侵入而發(fā)揮體外抗該病毒的作用［5］；朱砂七中的總蒽醌對流感病毒有一定的抑制作用［6］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)蒽醌類化合物具有抑制腫瘤的發(fā)生、促進(jìn)腫瘤凋亡的作用［7］。而有關(guān)朱砂七多糖的研究則報(bào)道較少，Cui J J等［8］的研究表明，給小鼠飼喂朱砂七粗多糖能顯著克服環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制，通過提高免疫抑制模型小鼠的過氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、總氧化能力及過氧化氫酶水平來預(yù)防免疫系統(tǒng)的氧化損傷。王曉梅等的研究顯示，朱砂七多糖在濃度為5 mg／mL 時(shí)，對O－2和·OH自由基清除率最高，分別為63%和48%，在濃度為0.09 mg／mL 時(shí)對亞硝酸鹽的清除率最高（67.03%），表明朱砂七多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性［9］。本課題組的前期研究初步證實(shí)，PCP 具有體外抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的作用［10］。有關(guān)朱砂七多糖對動(dòng)物腸道組織發(fā)育及在疫病防治方面的研究至今尚無報(bào)道，因此本試驗(yàn)就朱砂七多糖對雛雞十二指腸的組織發(fā)育及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞分布的影響進(jìn)行研究，為朱砂七資源的開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試多糖 朱砂七多糖，由本校動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)研究室制備并提供［13］。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 1 日齡非免疫羅曼公雞160只，購自陜西省武功鎮(zhèn)某孵化場，飼喂日糧采用華秦911A 蛋小雞配合飼料為陜西華秦飼料有限公司生產(chǎn)。采用立體籠養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.1.3 主要試劑與儀器 蘇木色精、甲苯胺藍(lán)為上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；堿性品紅和伊紅為Solarbio公司產(chǎn)品；LEICA RM 2126型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)為徠卡儀器有限公司生產(chǎn)；Motic數(shù)碼顯微鏡為廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋為北京市長風(fēng)儀器儀表公司生產(chǎn)；GTK－2002 自動(dòng)攤片烤片機(jī)為西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 1 日齡羅曼公雞常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組40只，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為朱砂七多糖試驗(yàn)組，第Ⅳ組為空白對照組。每天清晨在雞空腹時(shí)，分別在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的飲水中每天加 入 生 藥 含 量 分 別 為 低（0.3 g／kg）、中（0.5 g／kg）、高（0.7g／kg）劑量的朱砂七多糖，讓雞自由飲用。空白對照組（IV 組）不加藥液，讓雞自由飲水。

1.2.2 樣品采集 分別于給藥后的7、14、21d，每組隨機(jī)選取6只雛雞，顱面動(dòng)脈放血致死，迅速取十二指腸，用新配制的生理鹽水沖洗，放入Bouin′s液中固定48h以上。

1.2.3 十二指腸組織形態(tài)觀察 固定好的十二指腸組織按常規(guī)組織學(xué)方法制備石蠟切片，腸管連續(xù)橫切，制得3套切片，分別行HE 染色、PAS染色和肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色。腸道形態(tài)觀察參照Fleming等［11］的方法進(jìn)行，具體步驟：挑選五張染色清晰的切片，每張切片選取10根最長且走向平直、伸展良好的絨毛，通過Motic數(shù)碼顯微圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測量其絨毛高度（villum heigh，VH）及與之相連的隱窩深度（crypt depth，CD），并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度之比值（VH／CD）。十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocyte，IEL）、杯狀細(xì)胞（goblet cell，GC）和肥大細(xì)胞（mast cell，MC）數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參考文獻(xiàn)［12］介紹的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 朱砂七多糖對雛雞十二指腸發(fā)育的影響

鏡下可見，雛雞十二指腸組織結(jié)構(gòu)清晰、分層明顯，黏膜上皮和固有層向腸腔突出形成指狀的腸絨毛（圖1）。給藥后7d，各劑量PCP組和對照組雛雞十二指腸絨毛分布均勻、排列整齊，隱窩較淺；給藥后14d，各劑量的PCP組雛雞十二指腸絨毛高度明顯增大，其隱窩深度均小于對照組（圖1）；給藥后21d，各組雛雞的腸壁進(jìn)一步變粗，管徑增大，其組織學(xué)結(jié)構(gòu)與14d 時(shí)的相近。

經(jīng)Motic數(shù)碼顯微圖像處理系統(tǒng)測量各組雛雞的絨毛高度（VH）及與之相連的隱窩深度（CD），并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH／CD），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。7d時(shí)低、中、高劑量PCP 組絨毛高度均顯著高于對照組（P＜0.05），僅高劑量PCP 組隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05），低、中劑量PCP組絨毛高度與隱窩深度比值分別顯著（P＜0.05）和極顯著高于對照組（P＜0.01）；14d時(shí)低、中劑量PCP組絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05），高劑量PCP組絨毛高度極顯著高于對照組（P＜0.01）；低、中劑量PCP組隱窩深度分別顯著（P＜0.05）和極顯著低于對照組（P＜0.01），而中、高劑量PCP絨毛高度與隱窩深度比值均極顯著高于對照組（P ＜0.01）；21d時(shí)低、中、高劑量PCP 組絨毛高度均極顯著高于對照組（P＜0.01），低、中劑量PCP組隱窩深度分別顯著（P＜0.05）和極顯著低于對照組（P＜0.01），中、高劑量PCP組絨毛高度與隱窩深度比值均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 朱砂七多糖對雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

通過HE染色切片的觀察，黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞呈高腳玻璃杯狀、核位于細(xì)胞基部，胞質(zhì)呈空泡狀；黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞則散布于柱狀細(xì)胞之間，細(xì)胞核圓形、大而深染；PAS染色后，杯狀細(xì)胞胞質(zhì)呈紫紅色，結(jié)合兩種染色觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各組雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量（表2）。7d時(shí)低、中、高劑量PCP組黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.01）；14d時(shí)中、高劑量PCP組黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）高于對照組；21d 時(shí)低、中、高劑量PCP 組黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于對照組（P＜0.01）。7d 時(shí)中、高劑量PCP組黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量分別是極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）高于對照組；14d時(shí)中劑量PCP組黏膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著（P＜0.05）高于對照組；21d時(shí)中、高劑量PCP 組黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）高于對照組。

2.3 朱砂七多糖對雛雞十二指腸腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量的影響

經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，肥大細(xì)胞呈圓形或卵圓形，核呈空泡狀或淡藍(lán)色，胞質(zhì)內(nèi)充滿藍(lán)紫色顆粒。十二指腸壁中肥大細(xì)胞主要位于黏膜固有層和黏膜下層，肌層之間有零星分布。對各組雛雞十二指腸壁中肥大細(xì)胞分布進(jìn)行計(jì)數(shù)（表3）。7d時(shí)低、中、高劑量PCP組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量與對照組差異不顯著；14d時(shí)中、高劑量PCP 組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.05）；21d時(shí)低劑量PCP 組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05），而中、高劑量PCP組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量則均極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖1 給藥后14d 各組雛雞十二指腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)（100×）Fig.1 The histological structure of chicken duodenum on days 14after the PCP treatment（100×）

表1 朱砂七多糖對雛雞十二指腸絨毛高度、隱窩深度及二者比值的影響Table 1 Effects of PCP on the villum height（VH），the crypt depth（CD）and the ratio of villum height to crypt depth（VH／CD）in chicken duodenum

表1 朱砂七多糖對雛雞十二指腸絨毛高度、隱窩深度及二者比值的影響Table 1 Effects of PCP on the villum height（VH），the crypt depth（CD）and the ratio of villum height to crypt depth（VH／CD）in chicken duodenum

注：“＊”表示與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；“＊＊”表示與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。Note：Compared with the control group，“＊”means significant difference（P＜0.05）；and“＊＊”means extremely significant difference（P＜0.01）.

項(xiàng)目Item 組別Groups 7d 14d 21d對照組Control group1026.15±60.71 1156.20±69.98 1179.98±83.86絨毛高度／μmPCP低劑量Low－dose PCP 1114.78±50.13＊ 1289.43±140.93＊ 1455.63±123.17＊＊VHPCP中劑量Middle－dose PCP 1102.23±79.95＊ 1288.02±175.54＊ 1455.90±67.74＊＊PCP 高劑量High－dose PCP 1184.55±55.71＊ 1488.54±139.28＊＊ 1583.21±100.76＊＊對照組Control group 120.51±8.59 127.64±22.51 116.30±11.81隱窩深度／μmPCP低劑量Low－dose PCP 113.99±16.74 119.61±7.25＊ 102.49±9.39＊CDPCP中劑量Middle－dose PCP 113.27±14.33 105.21±33.66＊＊ 94.38±14.24＊＊PCP 高劑量High－dose PCP 105.24±12.11＊ 123.99±12.18 113.96±18.94對照組Control group 8.56±0.90 12.04±1.85 11.57±1.07絨毛高度與隱窩深度比值PCP低劑量Low－dose PCP 10.81±1.38＊ 13.22±1.99 12.67±2.19 VH／CDPCP中劑量Middle－dose PCP 11.37±1.35＊＊ 15.47±2.44＊＊ 13.15±2.93＊PCP 高劑量High－dose PCP 9.85±1.34 19.65±3.10＊＊ 17.21±3.67＊

表2 朱砂七多糖對雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響Table 2 Effects of PCP on number of intraepithelial lymphocytes（IEL）and goblet cells（GC）in duodenum epithelium mucosa of chickens

表2 朱砂七多糖對雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響Table 2 Effects of PCP on number of intraepithelial lymphocytes（IEL）and goblet cells（GC）in duodenum epithelium mucosa of chickens

注：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：以統(tǒng)計(jì)100個(gè)黏膜上皮柱狀細(xì)胞間IEL和GC的數(shù)量為準(zhǔn)?！埃北硎九c對照組相比差異顯著（P＜0.05）；“＊＊”表示與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。Note：Cell counting method：the number of GC and IEL were counted between 100columnar cells in epithelium mucosa.Compared with control group，“＊”means significant difference（P＜0.05），and“＊＊”means extremely significant difference（P＜0.01）.

項(xiàng)目Item 組別Groups 7d 14d 21d對照組Control group12.80±1.64 19.00±1.58 24.80±1.92上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞PCP低劑量Low－dose PCP 15.00±1.58＊ 20.00±1.58 27.40±1.14＊＊IELPCP中劑量Middle－dose PCP 16.40±1.14＊ 21.00±1.58＊ 28.20±1.30＊＊PCP 高劑量High－dose PCP 17.20±1.30＊ 22.00±1.58＊＊ 30.00±1.58＊＊對照組Control group 19.00±1.58 20.00±1.58 23.00±1.22杯狀細(xì)胞PCP低劑量low－dose PCP 20.00±1.58 21.00±2.92 25.00±1.58 GCPCP中劑量Middle－dose PCP 22.80±1.92＊＊ 23.80±2.39＊ 27.00±2.55＊PCP 高劑量High－dose PCP 21.80±1.92＊ 21.20±2.49 28.00±1.58＊＊

表3 朱砂七多糖對雛雞十二指腸腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量的影響Table 3 Effect of PCP on number of mast cells in chicken duodenum walls

表3 朱砂七多糖對雛雞十二指腸腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量的影響Table 3 Effect of PCP on number of mast cells in chicken duodenum walls

注：“＊”表示與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；“＊＊”表示與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。Note：Compared with the control group，“＊”means significant difference（P＜0.05），and“＊＊”means extremely significant difference（P＜0.01）.

組別Groups 7d 14d 21d對照組Control group314.20±7.26 348.60±7.23 446.20±10.76 PCP低劑量low－dose PCP 321.20±5.50 354.80±4.60 460.00±8.06＊PCP中劑量Middle－dose PCP 319.60±6.23 374.00±4.47＊ 481.00±11.09＊＊PCP 高劑量High－dose PCP 317.60±7.54 400.40±8.44＊ 497.00±10.70＊＊

3 討論

3.1 朱砂七多糖對雛雞十二指腸黏膜形態(tài)的影響

動(dòng)物小腸腸壁的黏膜及黏膜下層共同向管腔突出形成環(huán)形的褶皺、皺襞上有許多根指狀突起－小腸絨毛，而腸絨毛的表面是密集微絨毛組成的紋狀緣，這些結(jié)構(gòu)極大地增大了小腸黏膜的吸收表面積。因此，小腸組織結(jié)構(gòu)的完整性是其消化吸收功能的生理學(xué)基礎(chǔ)，其中小腸的絨毛高度、隱窩深度、腸壁厚度及絨毛表面積已成為衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。絨毛變短，說明腸黏膜上皮吸收細(xì)胞數(shù)量減少，其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力降低；腸隱窩是由腸絨毛基部上皮下陷至固有層內(nèi)形成的管狀結(jié)構(gòu)，其深度的變化提示隱窩細(xì)胞生長速度的快慢，在一定程度上影響消化和吸收機(jī)能［13］。而絨毛高度與隱窩深度的比值可綜合反映小腸黏膜的吸收功能狀況，比值下降表示黏膜受損，提示機(jī)體消化吸收功能降低，影響動(dòng)物的生長發(fā)育；比值上升則表明黏膜狀態(tài)有所改善，機(jī)體消化吸收功能增強(qiáng)，促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育［14］。

研究表明，有些植物多糖可促進(jìn)動(dòng)物腸道組織的發(fā)育。喬家運(yùn)等人研究了仔豬日糧中添加蘆薈多糖（aloe vera polysaccharide，AVP）后對腸道形態(tài)的影響，結(jié)果表明，日糧中添加蘆薈多糖后可提高十二指腸段、空腸前段和空腸后段的絨毛高度［2］。王留等研究大棗多糖對保育豬腸道微生物菌群及腸道組織形態(tài)的影響，結(jié)果表明，飼料中添加大棗多糖1 000mg／kg和1 500mg／kg時(shí)能夠促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的繁殖，并可通過顯著增加仔豬小腸各段的絨毛長度和降低腸道的隱窩深度提高腸道的消化吸收能力［3］。張勇等［15］報(bào)道證實(shí)在雛雞飼料中添加不同劑量的黃芪多糖能增加肉雞十二指腸絨毛高度、降低隱窩深度。本研究結(jié)果表明，飲水中添加朱砂七多糖7d后，各試驗(yàn)組雛雞十二指腸的絨毛高度均顯著高于對照組，高劑量PCP組隱窩深度顯著低于對照組，低、中劑量PCP 組絨毛高度與隱窩深度比值顯著高于對照組；給藥14d和21d后，各試驗(yàn)組雛雞十二指腸的絨毛高度顯著提高，隱窩深度則顯著降低，絨毛高度與隱窩深度比值顯著增大，表明添加PCP在一定程度上能促進(jìn)雛雞十二指腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有利于雛雞的生長發(fā)育。

3.2 朱砂七多糖對雛雞十二指腸壁組織內(nèi)黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞分布的影響

腸道黏膜及黏膜下層有大量的淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞存在，它們與黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞一起發(fā)揮重要的黏膜免疫功能，其中腸黏膜柱狀上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞作為最早接觸外來抗原的免疫活性細(xì)胞，承擔(dān)關(guān)鍵的黏膜免疫屏障的角色［16］，該種細(xì)胞數(shù)量的增加提示機(jī)體的腸道黏膜免疫功能狀態(tài)有所提高；杯狀細(xì)胞的主要功能是分泌黏液（成分主要為黏蛋白），對小腸黏膜上皮具有保護(hù)和潤滑作用，此外，黏液成分中的黏蛋白以及柱狀細(xì)胞分泌的復(fù)合糖蛋白結(jié)合形成黏膜表面的細(xì)胞衣（糖衣），后者與膜分子構(gòu)型中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)牢固嵌合，形成黏膜表面一道重要的物理屏障。肥大細(xì)胞廣泛存在于機(jī)體各處的結(jié)締組織中，除了參與機(jī)體的過敏和炎癥反應(yīng)外，在先天性免疫和獲得性免疫中也發(fā)揮著重要作用，因此肥大細(xì)胞也是機(jī)體中一種重要的免疫活性細(xì)胞［17］。有研究顯示，日糧中添加黃芪多糖可顯著增加羅非魚腸道黏液細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，表明飼料中添加黃芪多糖可以提高羅非魚機(jī)體的特異性免疫功能［18］。黃其春等的研究顯示，日糧中添加2g／L和2.5g／L 的銀杏葉提取物可顯著提高十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及杯狀細(xì)胞的數(shù)量而有助于增強(qiáng)肉仔雞十二指腸的黏膜免疫功能［19］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加低、中、高劑量的朱砂七多糖7、14、21d后，可顯著增加雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量；添加PCP 7d后，中、高劑量組雛雞十二指腸黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，添加14d后，各劑量PCP組黏膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組，添加21d后，中、高劑量PCP組黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增高。添加PCP 14d時(shí)，中、高劑量PCP組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組，而添加21d后各劑量PCP組腸壁肥大細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組。說明PCP 可通過增加雛雞十二指腸壁組織黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞（IEL、GC和MC）數(shù)量提高其黏膜免疫屏障功能。

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