披針葉黃華堿對奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌增殖的影響

李 勇，魏彥明，許 斌

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，寧夏銀川750021；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎為子宮內(nèi)膜的急性炎癥，常發(fā)生于分娩后的數(shù)天之內(nèi)，如不及時治療，炎癥易于擴(kuò)散，引起子宮漿膜或子宮周圍炎癥，最終導(dǎo)致長期不孕［1］。根據(jù)報道，不孕牛中有70%為產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎所致［2］。當(dāng)前，有關(guān)奶牛產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎的確切原因并十分不清楚，但多種非特定的病原微生物是引發(fā)本病的常見原因之一。由于不同地區(qū)、不同情況下分離得到的細(xì)菌種類和比例差異較大，臨床上多使用的抗菌藥物療法由于耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，治療效果不佳，不但使治療成本增加，還會引起乳制品中藥物殘留超標(biāo)，給食品安全帶來隱患。

披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）屬豆科野決明屬，主要分布在我國西北地區(qū)，該植物具有抗菌、消炎、清熱解毒、祛痰、提高免疫力等功效，所含生物堿對各種常見的革蘭陰性菌和陽性菌均有一定的抑制作用［3］。目前，國內(nèi)有關(guān)披針葉黃華生物堿對奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎抗菌效果的研究未見報道。本研究針對寧夏地區(qū)患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮黏膜中的病原菌進(jìn)行分離鑒定，依據(jù)相關(guān)理論，選取披針葉黃華總堿和單體堿，對造成奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗，為披針葉黃華堿的應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 依據(jù)奶牛臨床型子宮內(nèi)膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，在寧夏銀川市周邊多個奶牛場選擇20個產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的典型病例。先清洗患牛陰戶，用直腸把握法握住子宮頸，使子宮內(nèi)黏液流出產(chǎn)道，取子宮分泌物5mL，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備 披針葉黃華總堿（85.2%）、黃 華 堿（92.5%）、四 氫 脫 氧 阿 艮 亭 堿（90.3%）、金雀花堿（96.7%）均為筆者從寧夏鹽池地區(qū)產(chǎn)披針葉黃華中分離而得；腦心浸液瓊脂（BHIA）、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；鏈球菌鑒定系統(tǒng)gyz－12st、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管（GYZ－15e）購自上海江萊生物科技有限公司；30mL／L的H2O2溶液及革蘭細(xì)菌染液等均為寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室配制。冰箱，ARll40電子天平，超凈工作臺，立式壓力蒸汽滅菌器，恒溫培養(yǎng)箱，數(shù)顯生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病牛子宮中提取的黏液配成1∶10的稀釋液，用倍比稀釋法制的1∶1 000的稀釋液，取此稀釋液2份，每份0.1mL，分別接種于普通瓊脂平板和血液瓊脂平板上，在37℃有氧和厭氧條件下培養(yǎng)24h～48h。根據(jù)瓊脂平板上的菌落形態(tài)進(jìn)行分類，挑取同一類型數(shù)量較多、形態(tài)一致的單個菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，將染色特性相似的進(jìn)行歸類。對染色鏡檢菌體較雜的菌落，進(jìn)行劃線分離純化。純化的菌落接種至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用甘油保存。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 對革蘭染色呈紫色的陽性球菌做接觸酶試驗，若試驗過程中沒有氣泡產(chǎn)生則選用鏈球菌鑒定系統(tǒng)gyz－12st進(jìn)行鑒定［5］。對革蘭染色呈紅色的陰性桿菌做氧化酶試驗，若試驗結(jié)果呈陰性即無紫色反應(yīng)，則按照腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管（GYZ－15e）說明進(jìn)行操作［6］。另將革蘭染色呈陰性的桿菌接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，觀察生長情況，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心呈暗色的為可疑沙門菌，將可疑沙門菌穿刺接種于三糖鐵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h～24h后觀察。若穿刺底部有氣體，穿刺后變黑，中間為黃色表面為紅色則可初步認(rèn)定為沙門菌［7］。

1.2.3 生物堿藥液與細(xì)菌液的配制 用無菌蒸餾水將披針葉黃華總堿、黃華堿、四氫脫氧阿艮亭堿、金雀花堿配制成濃度為500mg／mL的生物堿藥液。配制好的受試藥物貯存液經(jīng)無菌處理后貯存于－20℃以下環(huán)境［8］。鏈球菌用100mL／L犢牛血清肉湯培養(yǎng)基接種，37℃培養(yǎng)18h～24h。大腸埃希菌和沙門菌用肉湯培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)后在血液瓊脂平板上劃線培養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)挑取單個菌落，接種于2mL～3mL的MH 肉湯中，37℃孵育18h～24h。

1.2.4 細(xì)菌的藥物敏感試驗（紙片法） 采用紙片法測定抑菌圈，進(jìn)行體外抗菌活性的預(yù)試驗。取細(xì)菌培養(yǎng)物，在營養(yǎng)瓊脂平板上密集均勻劃線。用無菌鑷子夾取各類生物堿藥物圓紙片，輕貼在已接種細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，一次放好，不能移動。平皿倒置，37℃溫箱中培養(yǎng)18h～24h。結(jié)果觀察。根據(jù)紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，初步判斷細(xì)菌對藥物的敏感性［9］。

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用試管雙倍稀釋法進(jìn)行抗菌藥最小抑菌濃度（MIC）測定［9－10］。取A、B、C、D4組試管，每組10支分別編號為1～10號，先將各管依次加入肉湯培養(yǎng)基5mL。再將先前低溫貯存濃度為500mg／mL的生物堿藥液分別在各組試管中從1～9號管作連續(xù)稀釋，即吸取5mL藥液加入1號管，混合均勻后吸取5mL加入2號管，混合均勻后吸取5mL加入3號管，如此稀釋至9號管混合均勻后吸取5mL棄去，第10管為不含生物堿藥液的生長對照。此時1～9 號管使之成為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.96mg／mL的濃度梯度。向A 組試管中依次加入大腸埃希菌，向B組依次加入溶血性鏈球菌，向C 組依次加入非溶血性鏈球菌，向D組依次加入沙門菌（每管加0.01mL預(yù)先用100倍稀釋的新鮮菌液），振蕩混勻。放置恒溫箱中37℃下培養(yǎng)12h后，以無細(xì)菌生長管中的藥液最大稀釋度為該藥的MIC。

1.2.6 結(jié)果判定 肉眼觀察，與生長對照管比較，無細(xì)菌生長的藥液最低濃度管，即為該藥液對受試菌的MIC。為使得結(jié)果更精確，每藥重復(fù)2次，其平均值即為受試菌的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果

依據(jù)染色鏡檢、鑒別培養(yǎng)和生化鑒定等指標(biāo)，病料感染率為100%，從20份病料樣本中共分離細(xì)菌68株，鑒定出大腸埃希菌（55.8%，38／68）、溶血性鏈球菌（20.5%，14／68）、非溶血性鏈球菌（14.7%，10／68）、沙門菌（9.0%，6／68）。病料中菌體形態(tài)有的呈卵圓形，長鏈狀排列，有β溶血環(huán)，染色后鏡檢呈革蘭陽性球菌；有的呈卵圓形，短鏈狀排列，無β溶血環(huán)，染色后鏡檢呈革蘭陽性球菌；有的呈圓形、光滑、濕潤、半透明，染色后鏡檢呈革蘭陰性球桿菌；有的則邊緣整齊，表面光滑，半透明，有凸起，染色后鏡檢呈革蘭陰性短桿菌；還有的呈圓形、隆起、光滑、濕潤，形成β溶血環(huán)，染色后鏡檢呈革蘭陰性球桿菌（表1）。

表1 分離出的菌株種類及特性Table 1 The species and characteristics of isolated bacteria

2.2 體外抗菌活性試驗

以分離鑒定的大腸埃希菌、溶血鏈球菌、非溶血鏈球菌以及沙門菌作為受試菌，以紙片法對不同濃度的四種受試藥物進(jìn)行體外抗菌活性試驗（表2）。

2.3 最小抑菌濃度測定結(jié)果

采用試管雙倍稀釋法進(jìn)行四種受試藥物對四種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）測定，結(jié)果見表3。

表2 不同濃度生物堿抑菌圈的測定結(jié)果（mm，n＝2）Table 2 The diamer of bacteriostasis zone of different concentrations of alkaloids fromThermopsis lanceolata

表3 不同濃度生物堿體外最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（mg·mL－1，n＝2）Table 3 The detection results of in vitro minimum bacteriostatic concentration of different concentrations of alkaloids fromThermopsis lanceolata

3 討論

分娩時或產(chǎn)后期間，微生物可以通過各種感染途徑侵入奶牛子宮，約有90%以上的奶牛分娩后子宮中可以分離出感染菌，這些細(xì)菌可短期或者長時間存在于子宮內(nèi)［11－12］。當(dāng)前引起奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、棒狀桿菌、假單胞菌、變形桿菌、生殖器桿菌、嗜血桿菌、乳酸菌、化膿性放線桿菌和壞死性梭菌和擬桿菌等［13］。由于奶牛子宮內(nèi)膜炎病原微生物區(qū)系比較復(fù)雜，不同地區(qū)不同情況下細(xì)菌種類和比例有差異，因此給治療和預(yù)防本病帶來極大的困難［14］。

本試驗對寧夏地區(qū)產(chǎn)后患子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮黏液中的病原菌進(jìn)行分離鑒定，感染率為100%。病料樣本中分離細(xì)菌68 株，鑒定出大腸埃希菌（55.8%，38／68）、溶血性鏈球菌（20.5%，14／68）、非溶血性鏈球菌（14.7%，10／68）、沙門菌（9.0%，6／68）。研究結(jié)果顯示，本次試驗中患奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的病原菌是以感染大腸埃希菌和溶血性鏈球菌為主，以混合感染為其主要感染方式，這一結(jié)果與王桂琴等［15］和李有文等［16］報道略有不同，此種差異可能是由于地區(qū)不同或各牛場所采用的治療情況不一而引起的。健康奶牛的子宮是處于一個相對無菌的環(huán)境，其自身的自凈能力很強(qiáng)，當(dāng)在分娩、助產(chǎn)或人工授精等過程中對子宮造成損傷等因素導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低時，可引起子宮內(nèi)的炎癥。奶牛子宮內(nèi)膜炎常在產(chǎn)后2 周內(nèi)發(fā)生，大多為急性感染為主［17］。通常情況下，產(chǎn)后健康奶牛子宮中的細(xì)菌數(shù)主要集中在產(chǎn)后3d～7d，產(chǎn)后9d后逐漸減少，而細(xì)菌感染除大腸埃希菌和葡萄球菌外均不具有連續(xù)性，隨著子宮復(fù)舊的不斷完善細(xì)菌逐漸減少［18］。

此次研究分離鑒定的主要致病菌大腸埃希菌、溶血性鏈球菌、非溶血性鏈球菌和沙門菌可能是與奶牛產(chǎn)后子宮中存在大量血液、脫落的子宮上皮組織等成分有關(guān)，因其營養(yǎng)豐富，利于微生物繁殖，加之奶牛產(chǎn)后護(hù)理不當(dāng)，自身抵抗力下降，導(dǎo)致病原微生物大量繁殖，從而引起奶牛發(fā)生產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。披針葉黃華總堿、黃華堿、四氫脫氧阿艮亭堿對寧夏地區(qū)引起奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的四種病原菌即大腸埃希菌、溶血性鏈球菌、非溶血性鏈球菌和沙門菌均有一定的體外抑菌活性，其中最為敏感的是非溶血性鏈球菌，其次為沙門菌、大腸埃希菌以及溶血性鏈球菌。而金雀花堿則對以上4種細(xì)菌無抗菌活性。因此，披針葉黃華總堿、黃華堿、四氫脫氧阿艮亭堿為披針葉黃華堿治療奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎相關(guān)制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

作為寧夏地區(qū)一種常見的天然植物，披針葉黃華中含有的黃華堿、四氫脫氧阿艮亭堿、右旋鷹爪豆堿、金雀花堿等多種生物堿具有清熱解毒、抗菌消炎、提高免疫力等功效，對本病的治療起到積極作用，是一種具有開發(fā)前景的中藥提取物。

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