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    小鼠和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)特性比較

    2015-06-11 02:22:00劉玉輝賴金倫寇明明鄧明亮劉瑞寧陳穎鈺胡長敏郭愛珍
    關(guān)鍵詞:傳代貼壁原代

    劉玉輝,賴金倫,寇明明,鄧明亮,劉瑞寧,陳穎鈺,2,胡長敏,2*,郭愛珍,2*

    (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430070)

    乳腺炎是嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物健康的常見疾病。奶牛乳腺炎被列為“奶牛三大疾病”之首,造成了奶牛業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,全世界約有2.2億頭奶牛,其中約有三分之一的奶?;加懈鞣N類型乳腺炎[1-2]。

    建立小鼠原代乳腺上皮細(xì)胞(mouse mammary epithelial cells,MMECs)和奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)體外分離培養(yǎng)體系是開展乳腺炎致病機(jī)制研究工作的基礎(chǔ)。Wang W 等[3]建立MMECs培養(yǎng)體系,研究中藥厚樸酚調(diào)控脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)MMECs炎癥反應(yīng)的機(jī)制。Olga W 等[4]也建立了BMECs培養(yǎng)體系研究病原菌與BMECs的相互作用。通過建立MMECs和BMECs體外培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)試驗(yàn)過程,既增加了試驗(yàn)的便利性,也減少了試驗(yàn)成本;同時(shí)可為乳腺生長發(fā)育、泌乳機(jī)制及乳腺生物反應(yīng)器的研究提供參考。

    1957年Lasfargues等首次實(shí)現(xiàn)了MMECs的直接培養(yǎng),成功建立了BMECs 細(xì)胞系BMGE+HM、BMGE+H 及EMGE-H[5]。張以濤等[6-7]分別研究了MMECs和BMECs體外培養(yǎng)特性,但有關(guān)MMECs及BMECs的分離培養(yǎng)、生長特性的比較研究尚未見報(bào)道。在本研究中,采用改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法分別從小鼠和奶牛乳腺中提取出高純度的MMECs及BMECs,進(jìn)行兩種細(xì)胞的體外培養(yǎng)傳代和凍存復(fù)蘇試驗(yàn),對比了MMECs和BMECs的分離、培養(yǎng)方法、生長特性、細(xì)胞傳代和復(fù)蘇性狀,為選擇及建立合適的MMECs和BMECs體外模型,以及開展乳腺相關(guān)功能研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 妊娠后期SPF 昆明鼠購自湖北省疾病控制中心,泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺組織采自湖北省某獸醫(yī)站。

    1.1.2 主要試劑及耗材 膠原酶(Collagenase)Ⅰ和Ⅱ?yàn)镾olarbio公司產(chǎn)品;2.5g/L 胰蛋白酶-0.2 g/L乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)為Gibico產(chǎn)品;胰島素(Insulin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、二甲基亞砜(DMSO)、兩性霉素B 和慶大霉素為Sigma公司產(chǎn)品;DMEM/F12、青鏈霉素雙抗(Penicilin-Streptomycin Solution)為Hyclone公司產(chǎn)品;表皮生長因子(EGF)為SinoBiological公司產(chǎn)品;兔源的角蛋白18多克隆抗體(Rabbit Anti-Cytokeratin18)為Bioss公司生產(chǎn);FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗為Southern Biotech公司 產(chǎn) 品;T25、T75 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 瓶12 孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Lab Serv公司產(chǎn)品。

    1.1.3 細(xì)胞消化液、培養(yǎng)液及凍存液 提取細(xì)胞時(shí)所用的消化液為2.5g/L Trypsin-0.2g/L EDTA與膠原酶Ⅰ、Ⅱ型等比例混合液,Ⅰ、Ⅱ型膠原酶均配制為2mg/mL 的工作液(100 mg膠原酶添加5 mL胎牛血清和45mL DMEM/F12)。細(xì) 胞生長培養(yǎng)液:基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12 添加100 mL/L FBS 10 mL/L Penicilin-Streptomycin Solution,5 ng/mL EGF,5μg/mL Insulin,5μg/mL Transferrin;凍存培養(yǎng)液:900 mL/L FBS+100 mL/L DMSO。

    1.2 方法

    1.2.1 MMECs的分離與純化 取健康妊娠后期SPF昆明鼠,斷頸處死后在750 mL/L 酒精中浸泡60s,無菌采集小鼠倒數(shù)第2對乳腺,避開血管且去除淋巴結(jié)后稱重;將采集到的乳腺組織放入含20 mL/L雙抗的PBS中,清洗干凈后置小燒杯中剪碎至糊狀,隨后轉(zhuǎn)入錐形瓶中密封,37℃、110r/min恒溫振蕩培養(yǎng)消化約2h~3h至無成塊組織(每克組織加入4mL Trypsin-EDTA 及4mL 膠原酶Ⅰ、Ⅱ等比例混合液,消化時(shí)間根據(jù)消化組織量而異);將消化后的勻漿液轉(zhuǎn)入15 mL 無菌離心管中25℃、250r/min離心5min。收集離心后的沉淀,加入適量含100mL/L FBS的DMEM/F12,用200目細(xì)胞篩過濾去除未消化組織塊。收集濾液,經(jīng)相同條件離心后棄上清,加入適當(dāng)2.5g/L Trypsin-0.2g/L EDTA 混合液重懸,作用2 min使細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞,隨后加入5mL含100mL/L FBS的DMEM/F12終止反應(yīng)。反復(fù)離心3次清洗沉淀后加入適當(dāng)培養(yǎng)液重懸,用400目細(xì)胞篩過濾后離心。沉淀中加入適量細(xì)胞生長液重懸后接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中差速貼壁1h,去除成纖維細(xì)胞,此操作重復(fù)2次,最后將細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.2.2 BMECs的分離與純化 健康泌乳中期荷斯坦奶牛屠宰時(shí),乳腺皮膚經(jīng)酒精消毒后用無菌手術(shù)刀切開,避開血管、脂肪及淋巴組織,剪取約5g腺泡處乳腺組織放入含2.5μg/mL兩性霉素B及50 μg/mL慶大霉素的PBS中,置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,提取步驟與1.2.1 MMECs相同,但奶牛乳腺組織振蕩消化時(shí)間約4h~4.5h。

    1.2.3 MMECs及BMECs的免疫熒光鑒定 將分離的MMECs接種于加有爬片的12孔板中培養(yǎng)至單層,以小鼠乳腺成纖維細(xì)胞作陰性對照;吸棄細(xì)胞生長液,PBS清洗3次后用40mL/L 多聚甲醛固定30min;同上清洗后取50 mL/L BSA 溶液封閉30 min;封閉完成后吸干封閉液,并將細(xì)胞充分浸泡于兔源角蛋白18多克隆抗體(稀釋倍數(shù)為1∶200)中,4℃孵育過夜;PBS清洗細(xì)胞后加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)為1∶100),室溫避光孵育1h;PBS清洗除去二抗,Hoechst 33342 室溫避光染色10min;抗熒光猝滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

    BMECs的固定、染色步驟及免疫熒光鑒定方法與MMECs的鑒定方法相同,同時(shí)設(shè)定奶牛乳腺成纖維細(xì)胞作陰性對照。

    1.2.4 MMECs及BMECs的傳代 MMECs及BMECs生長匯合至單層時(shí),用適量2.5g/L Trypsin-EDTA,37℃消化10min~15min,以1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代,補(bǔ)加生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.5 細(xì)胞生長曲線的繪制 將分離純化的MMECs和BMECs以1×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中,然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2d換液1次,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀連續(xù)8d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖,細(xì)胞數(shù)取3個(gè)孔的平均值。

    1.2.6 MMECs 及BMECs 的 凍 存 與 復(fù) 蘇MMECs及BMECs 凍存前同細(xì)胞傳代方法,見

    1.2.4 。取消化后細(xì)胞,25℃、1 000r/min 離心5 min,收集細(xì)胞;用1.1.3所示細(xì)胞凍存液將細(xì)胞分裝至1.5mL凍存管中,每管1mL,液氮中保存。解凍時(shí),從液氮中取出MMECs及BMECs凍存管,37℃水浴快速解凍細(xì)胞,而后加入細(xì)胞生長培養(yǎng)液,25℃、1 000r/min離心5min,收集細(xì)胞并接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    2 結(jié)果

    2.1 MMECs與BMECs分離、純化結(jié)果

    分別應(yīng)用改良的混合酶消化結(jié)合差速貼壁法成功提取了高純度的MMECs和BMECs。盡管兩種細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立步驟類似,但在取材部位、清洗液的選擇、清洗次數(shù)及消化時(shí)間等方面仍存在明顯差異(表1)。

    2.2 原代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

    2.2.1 原代MMECs培養(yǎng)特性 根據(jù)MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞貼壁速度的差異,經(jīng)兩次差速貼壁法將MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞分離。分離后的細(xì)胞培養(yǎng)3d左右,分別得到單一的MMECs與小鼠乳腺成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察,MMECs呈現(xiàn)典型的鋪路石樣外觀,且細(xì)胞連接緊密,間隙清晰(圖1a);當(dāng)MMECs長滿后繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)典型的穹頂狀結(jié)構(gòu),穹頂內(nèi)仍有一層MMECs(圖1b)。分離出的小鼠乳腺成纖維細(xì)胞呈典型的梭形(圖1c)。

    表1 MMECs與BMECs分離方法比較Table 1 Comparison of separation methods between MMECs and BMECs

    圖1 MMECs及小鼠乳腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察(10×)Fig.1 Morphology of MMECs and mouse mammary fibroblasts(10×)

    2.2.2 原代BMECs培養(yǎng)特性 通過改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法,分別獲得BMECs和奶牛成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察,BMECs輪廓清晰,排列緊密,呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣外觀。對BMECs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)跟蹤觀察評價(jià),原代BMECs呈島嶼狀生長,由中間向四周擴(kuò)散,細(xì)胞生長6d匯合成單層(圖2A)。奶牛乳腺成纖維細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞形態(tài)為梭形(圖2B)。

    2.3 傳代MMECs與BMECs培養(yǎng)特性

    2.3.1 MMECs傳代觀察 將MMECs以1∶2的比例進(jìn)行傳代,傳代細(xì)胞并未像原代MMECs出現(xiàn)鋪路石樣外觀,細(xì)胞間隙變大,排列不規(guī)則且不能匯合成單層(圖3)。

    2.3.2 BMECs傳代觀察 將BMECs以1∶2進(jìn)行傳代,傳代后2d細(xì)胞即匯合成單層,且傳代細(xì)胞與原代BMECs形態(tài)一致,細(xì)胞生長狀態(tài)良好(圖4a、圖4b)。當(dāng)BMECs傳至第9代時(shí),細(xì)胞出現(xiàn)了空泡與老化現(xiàn)象(圖4c、圖4d),死細(xì)胞增多。

    2.3.3 細(xì)胞生長曲線 以1×104個(gè)/mL 的細(xì)胞數(shù)將純化后的MMECs和BMECs(第2代)接種于24孔板中,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)得出的生長曲線見圖5。MMECs在接種到24 孔板中后,細(xì)胞出現(xiàn)生長緩慢,不能匯合成單層細(xì)胞狀態(tài),剛開始貼壁的細(xì)胞在隨后的生長過程中逐漸死亡,這與上述MMECs不能傳代相符;BMECs的生長曲線顯示:0~3d為細(xì)胞生長的滯留期,細(xì)胞處在適應(yīng)環(huán)境的過程,從第4天開始細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,直至第7天,之后細(xì)胞生長步入平臺(tái)期。

    2.4 MMECs與BMECs的凍存與復(fù)蘇

    使用相同的凍存液凍存MMECs和BMECs,復(fù)蘇后的細(xì)胞均能匯合為單層,且生長狀態(tài)良好。但MMECs只能凍存原代細(xì)胞,而BMECs可對傳代細(xì)胞進(jìn)行凍存(圖6)。

    2.5 MMECs與BMECs免疫熒光鑒定

    MMECs與BMECs經(jīng)兔源角蛋白18多克隆抗體孵育后加入FITC 標(biāo)記的熒光二抗,同時(shí)用Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核,置激光顯微鏡下觀察。角蛋白18特異性存在于MMECs與BMECs的胞質(zhì)中,經(jīng)免疫熒光染色后胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色,細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖7a、圖7c)。小鼠及奶牛乳腺成纖維細(xì)胞缺乏角蛋白18,僅細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(圖7b、圖7d)。

    3 討論

    3.1 MMECs和BMECs的分離鑒定

    圖2 BMECs及奶牛乳腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察(10×)Fig.2 Morphology of BMECs and bovine mammary fibroblasts(10×)

    圖3 傳代后的MMECs形態(tài)觀察(10×)Fig.3 Morphology of passaged MMECs(10×)

    在原代乳腺上皮細(xì)胞提取方法上,人們大多采用先胰酶粗消化后再用膠原酶消化的方法[8-9],由于乳腺組織中含有多種細(xì)胞,酶消化法提取出來的細(xì)胞多為乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物,因此仍需對提取所得細(xì)胞混合物進(jìn)一步純化。多項(xiàng)研究表明,成纖維細(xì)胞較乳腺上皮細(xì)胞對胰酶的敏感性高,在貼壁培養(yǎng)時(shí)不僅貼壁時(shí)間短,且貼壁后更易被胰酶消化。因此可根據(jù)成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞特性的差異,采用差時(shí)消化和差速貼壁的方法對乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行純化[10]。大多數(shù)人在純化方法上選擇根據(jù)兩種細(xì)胞對胰酶的敏感性差異開展純化[11],由于該方法是在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中進(jìn)行的,直接獲得的乳腺上皮細(xì)胞純度不高,且胰酶消化時(shí)間的不確定性也增加了純化的難度。

    圖4 傳代BMECs形態(tài)觀察Fig.4 Morphology of passaged BMECs

    圖5 小鼠和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長曲線Fig.5 Growth culture of MMECs and BMECs

    圖6 經(jīng)凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)(10×)Fig.6 Cell morphology after cryopreservation and resuscitation

    圖7 角蛋白18免疫熒光鑒定MMECs與BMECsFig.7 Cytokeratin18expression in MMECs and BMECs by immunofluorescence staining analysis

    本研究中,初始我們采用胰酶與膠原酶分段消化的方法分離MMECs,得到細(xì)胞成纖維細(xì)胞與乳腺上皮細(xì)胞的混合物,然后根據(jù)其對胰酶敏感性不同進(jìn)行純化,考慮到純化時(shí)胰酶量差異、消化時(shí)間的不確定性,以及胰酶反復(fù)作用造成乳腺上皮細(xì)胞損傷,隨后我們對乳腺上皮細(xì)胞的提取方法做了一些改良,一是在酶消化時(shí)采用胰酶與膠原酶Ⅰ、Ⅱ等量混合的方法進(jìn)行消化,直至將乳腺組織消化成無明顯可見大顆粒為止。改進(jìn)后的消化方法不僅減少了試驗(yàn)步驟,增加了試驗(yàn)的便捷性,而且混合酶同時(shí)消化乳腺組織,可以使乳腺組織消化更徹底充分,更容易獲得目的細(xì)胞。二是直接采用差速貼壁法,將混合酶消化后的兩種細(xì)胞混合物直接培養(yǎng),根據(jù)成纖維細(xì)胞先貼壁的特性將其去除,從而得到高純度的乳腺上皮細(xì)胞。

    角蛋白是乳腺上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志性蛋白,乳腺上皮細(xì)胞中的細(xì)胞骨架蛋白主要以角蛋白-7、8和18為主,而成纖維細(xì)胞中缺少角蛋白-18[12]。本研究通過角蛋白18 免疫熒光染色成功鑒定MMECs和BMECs。

    3.2 MMECs和BMECs生長特性

    MMECs和BMECs的形態(tài)存在差異,MMECs偏大,細(xì)胞趨向于多角形,細(xì)胞間排列緊密,細(xì)胞間隙小,呈鋪路石樣外觀;BMECs體積稍小,呈現(xiàn)鵝卵石樣外觀(圖1、圖2)。另外,BMECs培養(yǎng)初期細(xì)胞量少,后期細(xì)胞增殖快(圖2),可見BMECs分裂增殖能力較MMECs強(qiáng)。

    3.3 MMECs和BMECs的傳代特性

    在本研究中,MMECs傳代后老化,且不能長滿(圖3),這與易瓊等描述的MMECs 可以傳代不符[13],分析原因可能是乳腺上皮細(xì)胞的生長特性為形成乳腺細(xì)胞團(tuán)并以團(tuán)塊擴(kuò)張的形式生長[14],MMECs傳代減少了細(xì)胞量,以1∶2傳代的細(xì)胞密度仍然較低,導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)塊不能形成;另外,推測MMECs傳代過程中缺失了上皮細(xì)胞的某些成分或是生長培養(yǎng)基不能滿足傳代細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng),從而影響其分化增殖[15]。奶牛BMECs可以傳至第9代,但后續(xù)傳代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的易老化特征,細(xì)胞間形成空泡,細(xì)胞不能匯合成單層(圖4c、4d),這符合原代細(xì)胞的生長特性。

    同時(shí)純化后的MMECs和BMECs的生長曲線更進(jìn)一步說明了MMECs在細(xì)胞密度低的情況下不能生長,分裂增殖能力差;而BMECs的分裂增殖能力較強(qiáng),細(xì)胞的生長曲線呈現(xiàn)典型的S型,這與李文清等[16]描述相符。

    3.4 MMECs和BMECs的凍存與復(fù)蘇

    本研究中,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)到的凍存液(900 mL/L FBS+100mL/L DMSO)進(jìn)行MMECs和BMECs的凍存[17],復(fù)蘇凍存后的細(xì)胞生長良好。張以濤等以DMEM/F12∶FBS∶DMSO=7∶2∶1的凍存液成功凍存了MMECs,Danowski K 等[18]也以同樣比例的凍存液有效凍存了BMECs。由于MMECs不能傳代,因此直接對原代MMECs進(jìn)行凍存,所需細(xì)胞量大。而BMECs可用傳代細(xì)胞進(jìn)行凍存。

    4 小結(jié)

    本研究成功建立原代MMECs與BMECs細(xì)胞培養(yǎng)體系,同時(shí)比較了MMECs與BMECs的分離方法、體外生長培養(yǎng)、傳代及凍存與復(fù)蘇特性,但對于MMECs不能傳代的原因仍需作進(jìn)一步研究。開展培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞及建立乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究,不僅有助于建立乳腺生物反應(yīng)器及體外乳腺疾病研究模型,同時(shí)也為體外研究乳腺功能奠定了理論基礎(chǔ)。

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