豬呼吸道病相關(guān)的常見病毒PCR／RT－PCR 檢測方法的建立

韋冠東，王洪光，馬 萍，湯德元＊，張元鑫，曾智勇，劉 霞，唐 宇，李 達

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550008）

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化的不斷發(fā)展及治療豬病手段的不斷進步，隨之而來的疾病的種類也產(chǎn)生了變化，由以往的單一病原致病發(fā)展到多種病原混合感染和繼發(fā)感染。雖然藥物治療手段和效果越來越好，但隨之豬病的復(fù)雜程度及其危害也與日俱增。近年來，與豬呼吸道相關(guān)的疾病是我國豬群的常發(fā)病，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展，已經(jīng)受到廣泛重視。研究表明，PRV、PCV－2、CSFV、PRRSV、PPV 與SIV 等 病 毒是豬場發(fā)生的各類病毒性呼吸道相關(guān)疾病中最為常見的病原［1］。斷奶前后的仔豬和早期育肥豬是豬呼吸道相關(guān)疫病的主要侵害對象，尤其是剛斷奶的仔豬，由于失去母源抗體保護，自身免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全、沒有健全消化和呼吸系統(tǒng)功能，在斷奶、混群和飼料刺激等應(yīng)激下，豬群極易發(fā)?。?－3］。豬群發(fā)生呼吸道相關(guān)疫病的主要臨床癥狀有采食量下降、日漸消瘦；有明顯的呼吸道癥狀如咳嗽、喘氣、呼吸困難；眼部及鼻端分泌物增多、發(fā)熱等特征［4］。自1983年Mullis成功建立PCR 技術(shù)，隨著該方法應(yīng)用領(lǐng)域及方法的不斷進步與發(fā)展，現(xiàn)成為動物疫病診斷的重要方法之一，并廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域［5］。隨著PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，不同動物疫病病原的多重PCR 方法建立也越來越普遍，王洪光［6］等建立了PRRSV 與SIV 二重RT－PCR 檢測方法，能同時檢測PRRSV 與SIV。劉志杰［7］等建立了六重PCR 檢測方法，可以同時檢測PCV－2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV 和JEV 6 種豬繁殖障礙病毒性疫病。本試驗擬建立能夠快速、準(zhǔn)確檢測PRV、PCV－2、PPV、CSFV、PRRSV 與SIV6 種 病 原 的PCR 或RT－PCR 方法，以期對臨床病料進行準(zhǔn)確診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒及菌株 本研究中使用的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV 和SIV 系 病 豬組織中獲得，由貴州省動物疫病研究室分離并保存提 供；；pMD19－T Vector 和 大 腸 埃 希 菌 感 受 態(tài)Top10購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0RNA／DNA核酸提取試劑盒、DL Marker 2 000，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EZNA TM Gel Extraction Kit（50）膠回收試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒，Tiangen 公司產(chǎn)品；異丙醇、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑；Icycler Thermal cycler型PCR儀，Bio－Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 試驗根據(jù)GenBank 登錄的PRV gB（AF257079）、PCV－2 ORF2（NC－005148）、PRRSV ORF6（NC－001961）、CSFV C（AY805221）、PPV NS1（NC－001718）、SIV M（GU086140）等基因序列，應(yīng)用DNAStar、Oligo、MPprimer設(shè)計PCR／RT－PCR 引物，用于擴增目的基因片段［8］（表1）。

表1 擴增目的片段的引物Table 1 Specific primers used to amplify target genes

1.2.2 病毒核酸提取 分別取病毒液200μL，參照核酸提取試劑盒說明書，嚴(yán)格按步驟提取病毒RNA／DNA，利用蛋白質(zhì)核酸儀測定其濃度，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR／RT－PCR 反 應(yīng)體系 PRV、PCV－2、PPV 反應(yīng)體系為50μL，10×Taq PCR buffer 5 μL、dNTP（10 mmol／L）1 μL，上、下 游 引 物 各1μL，模板各1μL，r Taq 聚合酶1μL，滅菌超純水補足至50μL。反應(yīng)程序為：95 ℃5min；95 ℃30 s，57℃30s，72 ℃30s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PRRSV、CSFV、SIV 反應(yīng)體系為25μL，2×1step buffer 12.5μL，上、下游引物各1μL，模板各1μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1μL，RNase free H2O 8.5μL。反應(yīng)程序：50℃40min，95 ℃5min，95 ℃30s，57℃30s，72 ℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。分別取5.0μL PCR／RT－PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠上進行電泳測定。

1.2.4 PCR／RT－PCR 產(chǎn)物的鑒定 使用EZNA TM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，嚴(yán)格按照說明書步驟回收上述6種病毒的PCR／RT－PCR 擴增片段，將膠回收產(chǎn)物與pMD19－T 載體連接于16 ℃過夜，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞（Top10），經(jīng)Amp、IPTG、X－gal篩選，挑取單個白色菌落純培養(yǎng)后將陽性菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 PCR／RT－PCR 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 對PCR／RT－PCR 反應(yīng)退火溫度（51℃～60 ℃）進行優(yōu)化，以 確 定 最 佳Tm。PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃5min；95 ℃30s，（51℃～60 ℃）30s，72 ℃30s，35個循環(huán)；72℃10 min。RT－PCR 反應(yīng)條件：50℃40min；95℃5min，94℃30s，（51℃～60℃）30 s，72 ℃30s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10min。取5.0 μL PCR／RT－PCR 產(chǎn)物于10g／L 瓊脂糖進行凝膠電泳測定。

1.2.6 PCR／RT－PCR 特異性檢測 利用建立的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RTPCR 方法分別對彼此進行擴增，檢測該方法是否具有特異性。

1.2.7 PCR／RT－PCR 敏感性檢測 用蛋白質(zhì)核酸儀測定提取的6 種病毒的核酸濃度，并用RNase free H2O 進行101、102、103、104、105倍稀釋，分別取1μL 相應(yīng)倍比稀釋物進行PCR／RT－PCR 反應(yīng)，進行敏感性檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR／RT－PCR 產(chǎn)物的鑒定

將PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 產(chǎn) 物 連 接pMD19－T 載 體 后，轉(zhuǎn) 化TOP10 感受態(tài)細胞，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果表明，擴增片段為6種病毒的特異性基因片段。

2.2 PCR／RT－PCR 擴增結(jié)果

六種病毒PCR／RT－PCR 方法最佳退火溫度范圍均較廣，53℃～58℃檢測效果基本無差別，對PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 的 核 酸 模板進行PCR／RT－PCR 反應(yīng)，分別擴增出了192、255、364、530、759、981bp的特異性片段，各擴增片段的克隆測序結(jié)果表明，所擴增片段與預(yù)期結(jié)果大小一致，系目的基因序列（圖1）。

2.3 特異性檢測

利 用 建 立 的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 方法進行擴增，結(jié)果均為陰性，表明建立的方法特異性較好（圖2）。

2.4 PCR／RT－PCR敏感性檢測

對病毒核酸進行101～105倍稀釋，用建立的PRV、PCV－2、CSFV、PRRSV、PPV、SIV PCR／RTPCR 方法進行擴增，觀察其敏感性。發(fā)現(xiàn)該6種病毒核酸的檢測最低濃度依次為2.5×10－3、2.2×10－4、3.2×10－3、8.3×10－3、3.7×10－3、3.7×10－3ng（圖3）。

圖1 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV by PCR／RT－PCR

圖2 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR特異性試驗Fig.2 Specificity test of PCR or RT－PCR for detecting PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV

圖3 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of PCR／RT－PCR for detecting PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV

3 討論

建立PCR 檢測方法時，引物的設(shè)計是首要條件，試驗表明建立PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 的 最 佳 退 火 溫 度 范 圍 較廣，53℃～58℃檢測效果均較好。在敏感性試驗中，6種病毒的核酸檢測最低濃度依次為2.5×10－3、2.2×10－4、3.2×10－3、8.3×10－3、3.7×10－3、3.7×10－3ng。近幾年來，豬病毒性疾病發(fā)生對我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，我國規(guī)?；i場絕大多數(shù)都受到豬病毒性呼吸道疾病的威脅。PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 是 呼 吸 道病毒性疫病的重要病原，該類病原侵入呼吸道后，會造成呼吸道的防御屏障的破壞及呼吸道抗病毒能力的下降，繼而引起混合感染和繼發(fā)感染，由于導(dǎo)致呼吸道抵抗力的下降，使呼吸道類的疾病發(fā)病率變高，導(dǎo)致多種疫病同時發(fā)生，使疫病復(fù)雜化，病癥加重；同時PRRSV、PCV－2、CSFV、PPV、PRV 能夠損傷機體的免疫系統(tǒng)，降低豬群對外界環(huán)境的抵抗力，使得豬群發(fā)生疾病時多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況越來越普遍，由于這些病毒給機體造成相似臨床癥狀，導(dǎo)致疾病的診斷十分困難，難以及時給與相應(yīng)防治［9］。因此快速、準(zhǔn)確地診斷發(fā)病原因，從而及時有效的針對發(fā)病豬群采取相應(yīng)的藥物治療或免疫預(yù)防措施，降低疾病造成的經(jīng)濟損失具有重要的現(xiàn)實意義。

本 試 驗 針 對PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 等6種常見病毒的相關(guān)保守基因分別設(shè)計一對特異性引物，以擴增PRV gB、PCV－2ORF2、PRRSV ORF6、CSFV C、PPV NS1、SIV M 部分基因片段，應(yīng)用Primer Premier 5.0、Oligo 7.4、MFE primer和MP primer軟件進行綜合分析，充分考慮PRVG＋C 含量較高，PPVG＋C 含量較低的問題，Tm 值應(yīng)該控制在50℃～60℃，確保某一溫度都能進行很好的PCR 反應(yīng)，盡量避免引物間的非特異性擴增，為以后多重PCR 反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。建立的6種呼吸道相關(guān)病毒性疫病的PCR／RT－PCR 檢測方法，較理想的實現(xiàn)了上述6種病毒臨床病料的快速、準(zhǔn)確的檢測，該方法的建立為檢測以上6種病毒提供了有參考價值的方法。

［1］ 張家恭.豬呼吸道疾病綜合癥的發(fā)病機理與防控措施［J］.養(yǎng)殖與飼料，2008（9）：41－42.

［2］ Salichs M，SabatéD，Homedes J.Efficacy of ketoprofen administered in drinking water at a low dose for the treatment of porcine respiratory disease complex［J］.J Anim Sci，2013，91（9）：4469－4475.

［3］ TicóG，Segalés J，Martínez J.The blurred border between porcine circovirus type 2－systemic disease and porcine respiratory disease complex［J］.Vet Microbiol，2013，163（3－4）：242－247.

［4］ 劉翠權(quán).廣西395個規(guī)模豬場豬呼吸道疾病綜合征的病原學(xué)調(diào)查及防控措施［D］.江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［5］ 陶生策，張治平，張先恩.PCR 技術(shù)研究進展［J］.生物工程進展，2001，21（4）：26－29.

［6］ 王洪光，湯德元，曾智勇，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬流感病毒二重RT－PCR 檢測方法的建立［J］.豬業(yè)科學(xué)，2014（8）：98－100.

［7］ 劉志杰，曾智勇，湯德元，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，4（39）：1429－1436.

［8］ 王 穩(wěn)，屈武斌，申志勇，等.利用MPprimer設(shè)計引物并優(yōu)化擴增條件以提高多重PCR 效率的試驗研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2010，37（3）：342－346.

［9］ Darwicha L，Mateua E.Immunology of porcine circovirus type 2（PCV－2）［J］.Virus Res，2012，164：61－67.