C17－吡唑琳基甾體衍生物誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡研究

范寧娟，白育斌，師 偉，段 敏＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌712100）

在甾體分子結(jié)構(gòu)的D－環(huán)引入含N、O、S等雜原子的雜環(huán)后將使得甾體衍生物呈現(xiàn)廣泛的生物活性［1］。在雜環(huán)衍生物中，吡唑啉基甾體化合物因?yàn)榫哂兄雇?、抗菌、抗癌等功效為人們所熟悉，合成含有吡唑啉基的此類衍生物已?jīng)成為甾體結(jié)構(gòu)改造和修飾的重 要 分 支［2－5］。2013 年，我 們 合 成 了 一 系 列新穎的吡唑啉基甾體衍生物，體外細(xì)胞毒活性試驗(yàn)顯示部分化合物對肺癌（NCI－H460）、宮頸癌（Hela）和肝癌（HepG2）3種人體癌細(xì)胞具有較好的抑制活性，其中化合物1對Hela細(xì)胞的半數(shù)抑制率為12.5 μg／mL，細(xì)胞周期分析試驗(yàn)證明吡唑啉基甾體衍生物1（圖1）具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的特性［6］。據(jù)此推測吡唑啉基甾體衍生物1抑制Hela細(xì)胞增殖的活性可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯有關(guān)。

圖1 吡唑啉基甾體衍生物1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of derivative 1of steroidal derivatives

為了進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能，本研究將檢測C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞的凋亡的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步明確其抗腫瘤活性研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫細(xì)胞株信息庫。RPMI－1640培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購 自Gibico 公 司；Caspase－3、Caspase－8、Caspase－9活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù) 有 限 公 司；Bax、PARP、Bcl－2、β－actin 抗 體 購 于Santa Cruz。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗和ECL 顯 色 試 劑 盒 購 自Pierce 公 司；Annexin－VFITC／PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品合成 C17－吡唑琳基甾體衍生物1參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行合成，將合成的樣品溶于二甲基亞砜（DMSO）中，最終配制成2μg／μL 的儲(chǔ)存液（含0.5 mL／L DMSO）備用，DMSO終濃度不超過10mL／L。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 Hela細(xì)胞用100 mL／L胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。用2.5mL／L 的胰蛋白酶（含0.4mL／L的EDTA）消化傳代。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將Hela細(xì)胞接種至12孔板，待貼壁后，用12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理12、24、36、48h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200μL的PBS和2μL的AO／EB染色液（各含100 μg／mL），室溫避光孵育10min，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用DMSO 處理的細(xì)胞作為陰性對照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞凋亡率的影響 將Hela細(xì)胞接種于6孔板中，用，同時(shí)設(shè)置不用藥物處理的正常細(xì)胞為對照，于藥物處理后不同的時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、36、48h）收集細(xì)胞，1 000r／min 離心5 min，棄掉上清，用PBS洗滌2次，收集細(xì)胞。先加入195μL Annexin V－FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5μL Annexin V－FITC 和10μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，最后于室溫（20℃～25℃）避光孵育10min～20 min。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2 次～3 次以改善標(biāo)記效果。隨即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 用分光光度法檢測Caspase－3、－8和－9的活性 用12.5μg／mL 的藥物處理Hela細(xì)胞，分別于不同時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、36、48h）收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書在收集的沉淀細(xì)胞中加入200μL 的Lysis buffer，吹打均勻，置冰上裂解1h，其間渦旋振蕩3次，10 000r／min 離心1min，吸取上清至新的1.5mL EP管中。用BCA 法檢測所提取的蛋白質(zhì)濃度。分別吸取50μL 含總蛋白量為150μg的細(xì)胞裂解上清液，然后加入50μL 的2×Reaction buffer和5μL 的Caspase substrate，37 ℃避光孵育4h。以Lysis buffer 和Reaction buffer作為空白對照。在400nm 波長處測定吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)因子的變化

①細(xì)胞總蛋白的提取。收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入400μL的預(yù)冷的含有1mmol／L PMSF的RIPA 裂解液，冰上裂解1h，期間渦旋混勻4 次，12 000r／min離心20min，取上清，加入4×loading buffer，煮沸10min，置－80℃保存?zhèn)溆?。②線粒體蛋白與細(xì)胞漿蛋白的提取。收集細(xì)胞，PBS洗2次，4 ℃、600r／min離心10min，棄上清。加入1mL含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的線粒體分離試劑，重懸細(xì)胞，勻漿細(xì)胞，4 ℃、600r／min離心10 min，將上清移至新的離心管中，4℃、11 000r／min 離心10 min（上清為去除了線粒體的胞漿蛋白液，沉淀為線粒體）。冷卻后，置于－80℃中保存?zhèn)溆?。③Western blot分析與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的變化。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至用甲醇活化的PVDF膜上，用含有50g／L脫脂奶粉的PBS封閉2h，用含20g／L 脫脂奶粉的一抗4 ℃孵育過夜。次日，將PVDF 膜用PBST 洗滌3 次，每次6 min。然后將PVDF膜置于用20g／L脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1h，將PVDF 膜用PBST 緩沖液振搖洗滌5次，每次5min。將ECL試劑顯影。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 將試驗(yàn)所得結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Dunnet t的雙尾檢驗(yàn)多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，＊表示差異顯著（P＜0.05），＊＊表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 C17－吡唑琳基甾體衍生物1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

透射電鏡觀察C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理的Hela細(xì)胞，細(xì)胞核濃縮，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞核發(fā)生明顯的碎裂（圖2A）。熒光顯微鏡下觀察AO／EB 染色后的Hela 細(xì)胞，對照組細(xì)胞只被AO 染色，細(xì)胞核內(nèi)呈均勻的亮綠色熒光；而處理組細(xì)胞于12h開始出現(xiàn)核內(nèi)染色質(zhì)固縮，隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞核發(fā)生明顯的碎裂，晚期凋亡細(xì)胞的胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)（圖2C）。

2.2 C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞凋亡率的影響

根據(jù)Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，運(yùn)用雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，藥物處理細(xì)胞24h時(shí)，細(xì)胞凋亡率為21.3%，與對照組相比顯著極差異，在48h時(shí)細(xì)胞的凋亡率為52.4%，與對照組相比差異極顯著，表明C17－吡唑琳基甾體衍生物1能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞的凋亡率與處理時(shí)間正相關(guān)（圖2B）。

圖2 吡唑啉基甾體衍生物1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡Fig.2 C17－pyrazolinyl steroidal derivative induced apoptosis of Hela cells

2.2 C17－吡 唑 琳 基 甾 體 衍 生 物1 對Hela 細(xì) 胞Caspase活性的影響

利用Caspase檢測試劑盒檢測C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Caspase分子的活化的影響。12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細(xì)胞后，Caspase－8分子活性無顯著變化；而Caspase－3和Capase－9分子的活性在藥物處理12h后發(fā)生了顯著變化，在36h時(shí)，Caspase－3與Caspase－9的活性達(dá)到最高，與0h對照組細(xì)胞相比活性分別增加到了6.22和3.76倍，差異極顯著（圖3A）。

2.3 C17－吡唑琳基甾體衍生物1促進(jìn)Caspase－3的切割底物PARP的降解

Caspase－3的切割底物PARP 在C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后12h開始發(fā)生降解，隨著藥物處理時(shí)間的延長，PARP發(fā)生降解的程度越明顯，表明PARP能夠被活化后的Caspase－3 切割，細(xì)胞內(nèi)存在依賴于Caspase－3的其他凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活（圖3B）。

2.4 C17－吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Bcl－2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測表明，C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)量隨處理時(shí)間而增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)量則逐漸降低（圖4A）。

2.5 C17－吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Cytochrome c轉(zhuǎn)位的影響

通過Western blot檢測表明，藥物處理Hela細(xì)胞12h后，可以在胞漿中檢測到Cytochrome C，并且其表達(dá)量隨時(shí)間的延長而逐漸增加，說明Cytochrome C由線粒體釋放到胞漿，同時(shí)在胞漿中Bax表達(dá)量隨時(shí)間延長而降低（圖4B）。

圖3 吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Caspase活性的影響Fig.3 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Caspases activities of Hela cells

圖4 C17－吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Ba、Bcl－2和細(xì)胞色素C的作用Fig.4 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Bax，Bcl－2，and cytochrome C in Hela cells

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的程序性細(xì)胞死亡［7］。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，早期凋亡時(shí)，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)濃縮。中晚期凋亡時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞核碎裂，有凋亡小體的產(chǎn)生［8］。本研究利用AO／EB 染色，觀察C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后Hela細(xì)胞核形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物處理的Hela細(xì)胞的染色質(zhì)固縮，隨著處理時(shí)間的延長，核碎裂更加嚴(yán)重，最終導(dǎo)致凋亡小體的產(chǎn)生，為典型的凋亡細(xì)胞特征。

Caspases蛋白酶為天冬半胱氨酸蛋白酶，其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)裂解在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用［9］。細(xì)胞凋亡的信號通路主要包括死亡受體通路和線粒體通路［10］。死亡受體通路主要依賴于Caspase－8活化，線粒體通路的激活主要依賴于Caspase－9活化［11］。本研究檢測了Caspases活性，C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后，能夠活化Hela細(xì)胞內(nèi)的Caspase－3 和Caspase－9，而Caspase－8 的活性沒有顯著差異，表明該藥物能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Bcl－2家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，其家族成員主要包括促凋亡蛋白Bax、Bad、Bak 和抑凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－w 等，其中Bcl－2 和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白［12－14］。本研究發(fā)現(xiàn)，C17－吡唑琳基甾體衍生物1 處理Hela細(xì)胞后，Bax／Bcl－2的比率升高，胞漿內(nèi)游離的Bax 轉(zhuǎn)移到線粒體中，從而改變了線粒體膜的通透性，進(jìn)而使線粒體中的促凋亡分子Cyt c釋放到胞質(zhì)中，參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。綜上所述，合成的C17－吡唑琳基甾體衍生物1 能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用提供了依據(jù)。

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