去卵巢致大鼠腰椎間盤退變模型初探*

馮帥華 吳官保 楊屆 尹青 李勇敏 武海兵 劉澤庚

椎間盤退變引起的腰椎間盤突出、腰椎失穩(wěn)、滑脫等均是臨床上的常見病。國內(nèi)外關(guān)于椎間盤退變的病因和發(fā)病機(jī)制尚無定論，構(gòu)建能模擬人椎間盤退變的動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵，既往多采用直接或間接對(duì)椎間盤進(jìn)行損壞制作腰椎間盤退變模型，本研究改變既往造模方法，采用去卵巢方法，試圖建立女性絕經(jīng)后腰椎間盤退變的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8個(gè)月齡健康雌性SD大鼠（購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）30只，體重350~400 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立 30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：空白組（A組）、假手術(shù)組（B組）、模型組（C組），每組各10只。采用摘卵巢手術(shù)制造去勢(shì)大鼠模型方法：C組用氯胺酮（50 mg/kg）行腹腔注射麻醉，在無菌條件下從距離大鼠第一胸腰椎外側(cè)1 cm處縱向切開皮膚及兩側(cè)肌肉，摘除雙側(cè)卵巢[1]，B組則切除等同于卵巢體積大小的脂肪，止血后分兩層縫合，術(shù)后連續(xù)3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠10萬U單位/d，A組不做任何處理。

1.2.2 模型成功的判斷依據(jù) 陰道細(xì)胞涂片：術(shù)后24 h開始行陰道細(xì)胞涂片，連續(xù)5 d。用小滴管吸生理鹽水少許，滴于大鼠陰道口內(nèi)，吸出少量陰道分泌物，涂于載玻片上，立即置于95%的乙醇中固定30 min后取出晾干，做蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。去卵巢后大鼠表現(xiàn)為動(dòng)情間期，無或者有少量角化上皮細(xì)胞，表示去勢(shì)成功。

1.2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè) 第13周后處死所有大鼠，取出大鼠腰椎部分，剔除椎體周圍軟組織，經(jīng)L5/6、L6/S1椎間隙取出椎間盤組織。L5/6椎間盤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下對(duì)其椎間盤組織進(jìn)行觀察，利用Wang等制定的椎間盤組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)大鼠椎間盤髓核、纖維環(huán)及骨贅的形態(tài)學(xué)退變程度進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)退變程度的加劇其得分增加（髓核0~3分，纖維環(huán)0~2分，骨贅0~2分），一個(gè)椎間盤的得分為這3項(xiàng)得分的總和。同時(shí)每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)1個(gè)400倍高倍標(biāo)準(zhǔn)視野，進(jìn)行脊索細(xì)胞計(jì)數(shù)。將所取L6/S1椎間盤組織立即放入2.5%戊二醛溶液中固定24 h；2%的鋨酸固定2 h，0.1M二甲砷酸鈉沖洗3次，間隔2 h進(jìn)行一次后過夜；0.1M二甲砷酸鈉沖洗2次，間隔2 h進(jìn)行一次；乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂-環(huán)氧丙烷混合液浸泡24 h，Epon 812包埋；切片、染色，LKB-Ⅲ超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，厚度約500埃，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察、攝片：各標(biāo)本在不同視野和放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察椎間盤髓細(xì)胞數(shù)目和體積、胞漿內(nèi)容物（細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）形態(tài)改變情況，并攝片，用MICROTEK3600 掃描儀掃描負(fù)片，圖像輸入計(jì)算機(jī)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x-±s）表示，組間比較若方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法進(jìn)行方差分析和兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下椎間盤組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及退變程度評(píng)分 空白組和假手術(shù)組腰椎間盤纖維環(huán)與髓核排列基本規(guī)則，軟骨細(xì)胞單層排列與纖維膠原層交替分層，髓核中脊索細(xì)胞相對(duì)其他組豐富（見圖1、2）；模型組腰椎間盤纖維環(huán)膠原纖維層和軟骨細(xì)胞多分布不規(guī)則，膠原纖維減少或有裂隙，軟骨細(xì)胞增多，逐漸取代纖維成分或基本為軟骨成分，髓核成分減少或消失，可見骨化，皺縮，脊索細(xì)胞明顯減少或消失（見圖3）；喂養(yǎng)第13周后的退變程度評(píng)分比較：空白組（1.90±0.99）分，假手術(shù)組（2.10±1.10）分，模型組（5.00±1.10）分。假手術(shù)組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.691）；模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

圖1 空白組（HE染色×40）

圖2 假手術(shù)組（HE染色×40）

圖3 模型組（HE染色×40）

2.2 400倍光鏡下脊索細(xì)胞計(jì)數(shù) 治療第13周時(shí)隨機(jī)1個(gè)400倍高倍標(biāo)準(zhǔn)視野下脊索細(xì)胞數(shù)量：空白組（16.80±4.04）個(gè)，假手術(shù)組（16.20±4.13）個(gè)，模型組（10.30±4.06）個(gè)。模型組脊索細(xì)胞計(jì)數(shù)較空白組及假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.720），表明去卵巢后加速了大鼠椎間盤內(nèi)脊索細(xì)胞的消失，加速了椎間盤的退變。見圖4、5。

圖4 脊索細(xì)胞數(shù)量較少（HE染色×400）

2.3 髓核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 空白組和假手術(shù)組類軟骨細(xì)胞少，細(xì)胞稍有退變，細(xì)胞核呈卵圓形或圓形，核膜完整、光滑，異染色質(zhì)比較豐富，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比較豐富并且有小的線粒體，散在分布糖原顆粒及少量的脂肪滴，細(xì)胞外常見細(xì)突起，其外有基質(zhì)包圍，未有明顯的巢樣結(jié)構(gòu)（見圖6、7）；模型組類軟骨細(xì)胞更少見，退變程度明顯加重，和空白組比較差異較為顯著，周圍有大量細(xì)胞周間質(zhì)，形成鮮明的巢樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)溶酶體明顯增多，胞核扭曲變形，常染色質(zhì)凝集成塊，分布于核膜下或散在分布，胞漿基質(zhì)密度加深、線粒體空泡化加重，整個(gè)細(xì)胞體積明顯縮小，凋亡細(xì)胞核固縮成團(tuán)或碎裂成多塊，散在于胞質(zhì)中，胞質(zhì)模糊不清，在致密的無定形基質(zhì)中見一些粗顆粒狀物或空泡，胞膜缺如（見圖8）。

圖5 脊索細(xì)胞較多（HE染色×400）

圖6 空白組（×4.0K）

圖7 假手術(shù)組（×4.0K）

圖8 模型組（×4.0K）

3 討論

椎間盤由軟骨、外層的纖維環(huán)和內(nèi)部凝膠樣的髓核構(gòu)成，椎間盤細(xì)胞由髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞組成，脊索細(xì)胞存在于椎間盤髓核組織內(nèi)，起源于內(nèi)胚層。相關(guān)研究表明脊索細(xì)胞隨著人類年齡增長其數(shù)量會(huì)逐漸較少甚至消失，并逐步被軟骨細(xì)胞代替[2-3]。Wang等[4-5]發(fā)現(xiàn)髓核內(nèi)脊索細(xì)胞凋亡是椎間盤退變的起始點(diǎn)，是退變的主要病理基礎(chǔ)。從Guehring等[6]認(rèn)為，隨年齡的增長，脊索細(xì)胞的消失甚至被取代可能原因是椎間盤失去血運(yùn)所致。吳靖平等[7]發(fā)現(xiàn)增齡和應(yīng)力都能加速大鼠脊索細(xì)胞減少，從而加速椎間盤退變，其變化規(guī)律與人類一致。椎間盤纖維環(huán)破裂、髓核突出的組織病理學(xué)基礎(chǔ)是髓核細(xì)胞數(shù)量的減少以及其生理活性下降[8]。

椎間盤退變會(huì)導(dǎo)致一系列的脊柱類疾病，而其原因現(xiàn)未完全明確，從現(xiàn)有研究來看是多種因素作用的結(jié)果[9]。椎間盤退變始于髓核內(nèi)部細(xì)胞的凋亡和基質(zhì)的重建。外層纖維環(huán)隨退變的發(fā)展改變了它正常的板層排列結(jié)構(gòu)，降低了椎間盤承重的機(jī)械強(qiáng)度，隨退變程度增加，內(nèi)層纖維環(huán)出現(xiàn)放射狀裂隙，并向外層延伸，致椎間盤完整性的喪失，并逐隨之出現(xiàn)有椎間盤退變引起的腰椎間盤突出癥、腰椎椎體不穩(wěn)、腰椎側(cè)彎、腰椎旋轉(zhuǎn)畸形等疾病。椎間盤退變機(jī)制主要包括：家族遺傳，椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)減少，細(xì)胞凋亡失衡，基質(zhì)酶活性改變，生物力學(xué)機(jī)制的改變，細(xì)胞因子的作用及自身免疫反應(yīng)等[10-11]。

目前常用于研究椎間盤退行性疾病的模型可分為體內(nèi)、體外模型，體內(nèi)椎間盤退變模型可分為誘發(fā)性和自發(fā)性兩種，體外椎間盤退變模型可分為細(xì)胞培養(yǎng)模型和椎間盤組織培養(yǎng)模型[12]。誘發(fā)性椎間盤退變模型主要包括脊柱應(yīng)力改變、破壞脊柱結(jié)構(gòu)致脊柱失穩(wěn)、直接破壞椎間盤組織等方法，其中手術(shù)損傷椎間盤突出模型也是目前在研究椎間盤退行性變疾病中常用的方法[13]。但目前尚無公認(rèn)的能夠完全模擬人類椎間盤退變的標(biāo)準(zhǔn)模型[14]，因此臨床實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)充分考慮各模型的適用性及局限性，以便選擇合適的動(dòng)物模型，為了能更好地為人類椎間盤退變研究提供支持，椎間盤退變動(dòng)物模型的研究仍任重道遠(yuǎn)。

劉清華[15]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除去勢(shì)方法建立骨質(zhì)疏松大動(dòng)物模型可引起椎間盤退變。臨床工作中發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女出現(xiàn)腰椎退行性疾病的不在少數(shù)，絕經(jīng)這一因素是否加速了人類椎間盤退變目前尚無明確定論。本實(shí)驗(yàn)采用爬行類動(dòng)物大鼠作為研究對(duì)象，此類動(dòng)物在一定程度上減少了生物力學(xué)對(duì)椎間盤退變的影響，普通大鼠的平均壽命在2.0~3.5年，性成熟年齡在2~8個(gè)月之間，實(shí)驗(yàn)中選擇8個(gè)月齡性成熟大鼠，再行造模手術(shù)，使去卵巢這一因素是否參與了椎間盤退變更具有可信度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，大鼠去卵巢后第13周腰椎間盤組織形態(tài)退變嚴(yán)重、脊索細(xì)胞數(shù)量減少，其退變?cè)u(píng)分和脊索細(xì)胞計(jì)數(shù)和空白組及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），同時(shí)模型組髓核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退變較空白組及假手術(shù)組更為明顯。

綜上所述，去卵巢這一因素加速了大鼠椎間盤的退變，性成熟雌性大鼠通過去卵巢這一方法能初步建立腰椎間盤退變模型，這種模型模仿現(xiàn)實(shí)中絕經(jīng)婦女椎間盤退變模型，為臨床進(jìn)一步研究如何防止絕經(jīng)后婦女腰椎間盤退變提供初步動(dòng)物模型。

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