蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)方法及其不確定度評(píng)定*

金有訓(xùn) 石蓮花 武利慶 王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

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蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)方法及其不確定度評(píng)定*

金有訓(xùn) 石蓮花 武利慶 王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

本文研究建立了一種蛋白質(zhì)純化分析儀的校準(zhǔn)方法，確定了蛋白質(zhì)純化分析儀的主要計(jì)量特性包括泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性極差SR、紫外-可見檢測(cè)器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機(jī)性能的定性、定量測(cè)量重復(fù)性、pH和電導(dǎo)測(cè)定重復(fù)性等。介紹了采用人生長(zhǎng)激素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、氯化鉀電導(dǎo)率標(biāo)準(zhǔn)溶液和pH標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器主要計(jì)量特性指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)的過(guò)程，并對(duì)流量設(shè)定值誤差的不確定度評(píng)定進(jìn)行了討論。本研究工作有助于保證蛋白質(zhì)純化分析儀測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和溯源性，并為蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)規(guī)范的制定奠定基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)純化分析儀；計(jì)量特性；校準(zhǔn)；不確定度

0 引言

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類生物大分子，由核酸編碼的a -氨基酸之間通過(guò)a -氨基和a -羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經(jīng)翻譯后加工而生成的具有特定立體結(jié)構(gòu)的、有活性的大分子。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展以及生物產(chǎn)業(yè)的興起，蛋白質(zhì)純化分析在臨床檢驗(yàn)、食品安全、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用與日俱增，蛋白質(zhì)純度與大眾健康緊密相連。許多重要的臨床生化指標(biāo)都離不開蛋白質(zhì)的純化及純度分析，并且臨床檢驗(yàn)儀器的檢定和校準(zhǔn)同樣也離不開高純度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

蛋白質(zhì)純化分析儀根據(jù)所要純化的目的蛋白的特性，利用液相色譜結(jié)合不同的色譜柱可以進(jìn)行凝膠過(guò)濾、離子交換、疏水層析、反相層析和親和層析，可用于分離和純化各種生物分子，包括天然蛋白質(zhì)，重組和融合蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、質(zhì)粒、病毒、抗生素、生物堿等，可以檢測(cè)、分離、純化環(huán)境微生物、植物、動(dòng)物和人體中的多種生物分子[1-3]。尤其適用于檢測(cè)、純化、分離制備蛋白質(zhì)，包括已知和未知蛋白質(zhì)的純化，蛋白藥物的分離，病毒等生物顆粒的分離[4]。顯然蛋白質(zhì)純化分析儀的性能將會(huì)影響到蛋白質(zhì)檢測(cè)、分離、純化的最終結(jié)果。

因此，為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確，有必要對(duì)蛋白質(zhì)純化分析儀的性能進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制。迄今為止，國(guó)家尚未出臺(tái)有關(guān)蛋白質(zhì)純化分析儀的檢定規(guī)程或校準(zhǔn)規(guī)范，并且蛋白質(zhì)純化分析儀的需求和數(shù)量是日益增長(zhǎng)的，確保其結(jié)果的準(zhǔn)確性和溯源性有必要對(duì)儀器性能進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制。因此，本工作對(duì)蛋白質(zhì)純化分析儀的計(jì)量特性指標(biāo)及其校準(zhǔn)方法進(jìn)行了研究，并對(duì)計(jì)量特性指標(biāo)中流量設(shè)定值誤差的不確定度評(píng)定進(jìn)行了討論，滿足了蛋白質(zhì)純化分析儀的質(zhì)量控制和校準(zhǔn)的需求。

1 計(jì)量特性和計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)

蛋白質(zhì)純化分析儀通常采用高效液相色譜原理，它是由泵系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱(柱溫箱)、紫外-可見 (UV-Vis) 檢測(cè)器、在線電導(dǎo)和pH檢測(cè)的組合檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。蛋白質(zhì)純化分析儀利用樣品中各組分在色譜柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相間分配或吸附特性的差異，由流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱中進(jìn)行分離，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，依據(jù)各組分的保留時(shí)間和響應(yīng)值(峰面積或峰高)進(jìn)行定性和定量分析。泵系統(tǒng)是蛋白質(zhì)純化分析儀中很重要的部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。考慮到蛋白質(zhì)純化分析儀的泵系統(tǒng)流量是否穩(wěn)定可能影響到蛋白質(zhì)純化分析儀檢測(cè)、分離、純化結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，特別是影響到定性定量的準(zhǔn)確性。因此，參照J(rèn)JG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》，將泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS和流量穩(wěn)定性極差SR作為一項(xiàng)計(jì)量特性。檢測(cè)器是蛋白質(zhì)純化分析儀的關(guān)鍵部件之一，其中紫外-可見檢測(cè)器的基線噪聲和基線漂移都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，尤其是影響到定性定量的準(zhǔn)確性和精密性，因此，將紫外-可見檢測(cè)器的基線噪聲和基線漂移作為計(jì)量特性之一[5]。儀器整機(jī)性能的定性、定量測(cè)量重復(fù)性好壞也會(huì)影響到定性定量的準(zhǔn)確性，也應(yīng)作為計(jì)量特性之一。此外，pH和電導(dǎo)率重復(fù)性[6]穩(wěn)定也將影響到蛋白質(zhì)純化分析儀檢測(cè)、分離、純化結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，也將其性能作為計(jì)量特性。通過(guò)參考相關(guān)的檢定規(guī)程和查閱大量技術(shù)資料，我們反復(fù)做了相關(guān)計(jì)量特性有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，最終確定了蛋白質(zhì)純化分析儀泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性極差SR、紫外-可見檢測(cè)器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機(jī)性能的定性、定量測(cè)量重復(fù)性、pH和電導(dǎo)測(cè)定重復(fù)性等作為計(jì)量特性。各種計(jì)量特性指標(biāo)要求見表1和表2。校準(zhǔn)過(guò)程中使用的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)和計(jì)量?jī)x器如表3所示。

表1 泵流量設(shè)定值誤差SS和泵流量穩(wěn)定性極差SR的指標(biāo)要求

表2 蛋白質(zhì)純化分析儀的主要技術(shù)指標(biāo)

表3 蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)過(guò)程中使用的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)與計(jì)量?jī)x器

2 校準(zhǔn)方法

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)當(dāng)滿足儀器安裝的要求，周圍無(wú)強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)和電磁干擾源，儀器接地良好，蛋白純化分析儀周圍環(huán)境的溫度應(yīng)當(dāng)控制在15～30℃，相對(duì)濕度在20%～85%環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試，配套使用的流動(dòng)相應(yīng)當(dāng)新鮮配制。接通儀器電源后預(yù)熱10 min，待儀器各電子器件狀態(tài)穩(wěn)定后開始測(cè)試。然后按照下述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1 泵流量設(shè)定值誤差Ss、流量穩(wěn)定性極差SR的檢測(cè)

蛋白質(zhì)純化分析儀流量設(shè)定值誤差Ss、流量穩(wěn)定性極差SR檢測(cè)的相關(guān)步驟以及計(jì)算公式是參照J(rèn)JG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》，以純水為流動(dòng)相，按表1指標(biāo)的要求，啟動(dòng)儀器，壓力穩(wěn)定后，在流動(dòng)相出口處用事先清洗稱重過(guò)的容量瓶收集流動(dòng)相，自動(dòng)收集設(shè)定時(shí)間流出的流動(dòng)相，在分析天平上稱重，重復(fù)測(cè)量3次，按式(1)、式(2)和式(3)計(jì)算SS和SR。

Fm= (W2-W1)/(ρ(t)

(1)

(2)

(3)

2.2 基線噪聲和基線漂移的檢測(cè)

以純水為流動(dòng)相，流量為1.0mL/min，紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)選在215nm，檢測(cè)靈敏度調(diào)到最靈敏擋。開機(jī)預(yù)熱，待儀器穩(wěn)定后記錄基線30min，計(jì)算基線噪聲，用檢測(cè)器自身的物理量(AU) 作單位表示。基線漂移用30min內(nèi)基線偏離原點(diǎn)的值(AU/30min) 表示。

2.3 電導(dǎo)率重復(fù)性的檢測(cè)

開機(jī)后先用純水以5mL/min流速清洗系統(tǒng)5min，然后，用氯化鉀電導(dǎo)率溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[6]預(yù)平衡系統(tǒng)，重復(fù)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液共6次，記錄儀器的電導(dǎo)率，按式(4)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為重復(fù)性的表征。

(4)

2.4 pH重復(fù)性的檢測(cè)

測(cè)pH重復(fù)性時(shí)先用純水以5 mL/min流速清洗系統(tǒng)5 min，然后，用pH標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)平衡系統(tǒng)，重復(fù)測(cè)量pH標(biāo)準(zhǔn)溶液pH值共6次，記錄儀器的pH值，按式(4)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為重復(fù)性的表征。

2.5 整機(jī)性能的定性、定量重復(fù)性的檢測(cè)

參照J(rèn)JG 705—2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》，將儀器各部分連接好，選用凝膠過(guò)濾、離子交換色譜、疏水作用色譜、親和層析色譜等色譜柱，選擇相適應(yīng)的流動(dòng)相和測(cè)量參數(shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，基線穩(wěn)定后由注射器注入50μL的1mg/mL人生長(zhǎng)激素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。連續(xù)測(cè)量6次，分別記錄色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間和峰面積，根據(jù)式(4)，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算定量重復(fù)性，以保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算定性重復(fù)性。

3 不確定度評(píng)定

本研究對(duì)泵流量設(shè)定誤差進(jìn)行了不確定度評(píng)定。根據(jù)上述分析，其數(shù)學(xué)模型為式(1)。由數(shù)學(xué)模型可知，流量設(shè)定誤差校準(zhǔn)不確定度的來(lái)源主要有流動(dòng)相質(zhì)量 (W2-W1)、流動(dòng)相的密度 (ρ)、時(shí)間 (t)、測(cè)量重復(fù)性 (rep)。其不確定度分量包括：u(W1)、u(W2)、u(ρ)、u(t)、u(rep)。

3.1 流量重復(fù)性引入的不確定度分量u(rep)

采用不確定評(píng)定A類方法對(duì)流量重復(fù)性分量進(jìn)行評(píng)定，按式(1)計(jì)算流量Fm，重復(fù)測(cè)量3次，用極差法可簡(jiǎn)單迅速算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，一般在n<10時(shí)采用，根據(jù)極差法公式(5)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

(5)

式中：xmax為同一設(shè)定流量3次測(cè)量值的最大值，mL/min；xmin為同一設(shè)定流量3次測(cè)量值的最小值，mL/min；dn為是極差系數(shù)，測(cè)量次數(shù)3時(shí)相應(yīng)的極差系數(shù)是1.69。

其平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

流量重復(fù)性引入的不確定度分量：

3.2 稱量引入的不確定度分量u(w1)、u(w2)

采用不確定評(píng)定B類方法對(duì)稱量時(shí)所引入的W2、W1進(jìn)行評(píng)定，天平最大允許誤差為0.01 mg，假設(shè)為均勻分布、則由稱量引入的不確定度分量為：

3.3 密度引入的不確定度分量

采用不確定評(píng)定B類方法對(duì)密度所引入的不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，密度最大允許誤差為1×10-6，因此，對(duì)密度引入的不確定度分量忽略不計(jì)[7]。

3.4 時(shí)間引入的不確定度分量

因儀器自動(dòng)記錄收集時(shí)間，可以忽略。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度

靈敏系數(shù)ci按式(6)計(jì)算：

ci=?f/?xi

(6)

根據(jù)數(shù)學(xué)模型各參數(shù)的靈敏系數(shù)為：

按B類方法評(píng)定的合成不確定度為：

將以上不確定度分量合成得到標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度:

3.6 測(cè)量擴(kuò)展不確定度

在最佳測(cè)量能力條件下，取包含因子k=2，則流量引用的擴(kuò)展不確定度為：U=2×uc。

4 結(jié)論

隨著目前分析儀器行業(yè)飛速發(fā)展，這就要求檢定員在儀器檢定過(guò)程中不斷摸索改進(jìn)，對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行補(bǔ)充完善，提高檢定規(guī)程/校準(zhǔn)規(guī)范的可操作性。既要制定對(duì)新分析儀器的嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的檢定校準(zhǔn)方法又要盡量滿足客戶的需求，使檢定校準(zhǔn)方法向著快捷、實(shí)用、科學(xué)的方向發(fā)展。本文提出了蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)泵系統(tǒng)的流量設(shè)定值誤差SS、流量穩(wěn)定性誤差SR、紫外-可見檢測(cè)器的基線噪聲和基線漂移、儀器整機(jī)性能的定性、定量測(cè)量重復(fù)性，儀器pH和電導(dǎo)率重復(fù)性等蛋白質(zhì)純化分析儀計(jì)量性能指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)。依據(jù)本文提出的蛋白質(zhì)純化分析儀校準(zhǔn)方法，筆者起草了中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院蛋白質(zhì)純化分析儀作業(yè)指導(dǎo)書，對(duì)外開展蛋白質(zhì)純化分析儀測(cè)試業(yè)務(wù)，先后在蛋白質(zhì)純化分析儀上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，獲得了滿意的效果。

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10.3969/j.issn.1000-0771.2015.07.14