大孔吸附樹脂對喜樹葉中喜樹堿的純化工藝研究

馬云超，馬珊珊，郭繼業(yè)，宋 冰，丁孝營，徐珊珊

(1.吉林市農業(yè)科學院，吉林 吉林 132101；2.吉林市社會福利院，吉林 吉林 132012)

喜樹堿(PT)為具有內酯環(huán)結構的喹啉類生物堿，繼1966年Wall等首次從喜樹植物中分離出喜樹堿之后，人們對喜樹堿的生物和化學性質進行了大量的研究，主要是針對抗腫瘤研究領域。喜樹堿的抗癌作用，起初認為是喜樹堿通過抑制核酸合成，導致癌細胞內DNA降解，近年來研究結果否定了這一觀點，研究發(fā)現喜樹堿主要是通過抑制癌細胞DNA復制酶，阻礙癌細胞的增殖。1988年又進一步發(fā)現喜樹堿主要是通過阻斷DNA拓撲異構酶I(Topoisonmerase I)合成，發(fā)揮細胞毒性的獨特抗癌機理[1]。

傳統(tǒng)工藝上，多用氯仿或氯仿/甲醇提取乙醇萃取液中的喜樹堿，由于氯仿的高溶劑毒性及低選擇性，導致氯仿萃取物中喜樹堿含量較低且化合物復雜，給喜樹堿精制和分離帶來困難。

大孔樹脂是20世紀70年代發(fā)展起來的一種高吸附性的有機高聚物，它包括大孔吸附樹脂和大孔離子交換樹脂[2]。大孔吸附樹脂不含有離子交換基團，是以苯乙烯和丙烯酸酯為單體，加入交聯劑和致孔劑，相互交聯聚合而成多孔骨架結構，其吸附原理是利用自身巨大的表面積，通過范德華力與被吸附組分發(fā)生物理性作用，并依據化合物相對分子質量大小及吸附力強弱的差別，達到分離提純的目的[3]。與其它柱層析吸附劑相比，大孔樹脂具有吸附容量大、物理穩(wěn)定性好、機械強度大、易被有機溶劑選擇性洗脫、再生性良好的優(yōu)勢。

實驗選用5種非/弱極性大孔吸附樹脂，通過靜態(tài)吸附與解吸實驗，對樹脂進行篩選。結合動態(tài)實驗對樹脂純化工藝以及樹脂再生性進行研究，從而確定利用大孔吸附樹脂對天然產物中喜樹堿分離的工業(yè)技術可行性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用溶劑除乙腈外均為分析純；乙腈為高效液相色譜純；蒸餾水及超純水為實驗室自制；喜樹堿標準品質量分數為95.8%，喜樹葉采自浙江桐廬浙江林學院培植基地四年生喜樹；D101、D201、D402、AB-8、X-5大孔吸附樹脂購于天津南開大學化工廠。

LC-6A高效液相色譜系統(tǒng)、UV-2450紫外檢測器、AUY220型電子分析天平：日本島津株式會社；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-S14型恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；DGG-9240B型電熱恒溫干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 喜樹堿樣品液的制備與含量測定

稱取喜樹葉干粉，置于70 ℃的恒溫水浴中，用體積分數65%的甲醇水溶液，料液比1∶10，回流提取1 h，37 ℃下減壓濃縮，得到喜樹堿的樣品液。HPLC測定ρ(樣品液)。

1.2.2 大孔吸附樹脂的預處理與再生

將D101、D201、D402、AB-8、X-5 5種大孔吸附樹脂用體積分數95%的乙醇浸泡2 d，傾去上浮物后抽濾，重復操作，直至乙醇洗滌液澄清且加水不產生乳白色渾濁現象，然后用大量蒸餾水浸沒保存，備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附/解吸實驗

取濕樹脂各2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加入0.175 mg/mL的喜樹堿樣品液100 mL，25±2 ℃震蕩24 h。吸附平衡后，取清液1 mL，甲醇定容至10 mL，HPLC測定ρ(吸附殘液)。

將吸附后的樹脂洗滌抽濾，然后置于150 mL三角瓶中，加入體積分數95%的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震蕩解吸24 h，解吸平衡后，抽濾，并用少量乙醇洗滌，合并濾液及洗滌液，用體積分數95%的乙醇定容至100 mL，HPLC測定ρ(解吸液)。

計算公式如下：

(1)

(2)

其中：ρ1為 解吸液質量濃度；ρ0為吸附液質量濃度；ρr為吸附殘液質量濃度；V為吸附液體積；V1為解吸溶劑體積；m為樹脂的干重。

1.2.4 大孔吸附樹脂純化工藝研究

1.2.4.1 大孔吸附樹脂的吸附動力學曲線

取AB-8樹脂2.5 g，加入ρ(喜樹堿)為0.175 mg/mL的溶液100 mL，靜態(tài)吸附10 h，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h，各移取上清液1 mL，HPLC測定吸附殘液中ρ(喜樹堿)，繪制樹脂的吸附動力學曲線。

1.2.4.2 大孔吸附樹脂吸附透過曲線

取3支玻璃層析柱(20 mm×400 mm)，各加AB-8樹脂30 mL(樹脂干重5.51 g)，樣品溶液上樣，吸附流速2BV/h，每1BV收集一次，逐次標記，HPLC測定流出液中ρ(喜樹堿)并繪制吸附透過曲線。

1.2.4.3 pH值對大孔吸附樹脂的吸附性能影響

取AB-8濕樹脂2.5 g，5份，分別加入pH=4、6、8、10、12的樣品溶液100 mL，靜態(tài)吸附24 h，HPLC測定ρ(吸附殘液)。

1.2.4.4 ρ(洗脫液)對樹脂洗脫性能的影響

取AB-8濕樹脂2.5 g，5份，靜態(tài)吸附24 h。將樹脂抽濾洗滌后，置于150 mL三角瓶中，加入φ(乙醇)分別為30、50、70、80、95的乙醇50 mL，在25±2 ℃下，震蕩解析24 h，HPLC測定ρ(解吸液)。

1.2.4.5 洗脫流速對樹脂解吸性能的影響

將樣品溶液700 mL，共3份，以2 BV/h吸附流速通過裝有30 mLAB-8樹脂的層析柱，平衡5 h，用3BV蒸餾水洗滌柱床，最后用體積分數95%的乙醇洗脫，洗脫流速為1、2、3 BV/h，洗脫體積9BV，HPLC測定流出液和洗脫液中ρ(喜樹堿)。

1.2.4.6 樹脂穩(wěn)定性研究

將AB-8濕樹脂2.5 g，按1.2.3方法解吸。解吸后，將樹脂置于150 mL三角瓶中，加入50 mL體積分數95%的乙醇，磁力攪拌30 min對樹脂再生，然后過濾，蒸餾水洗滌樹脂，將再生后的樹脂二次進行吸附與解吸，如此重復操作4次，HPLC測定各次ρ(吸附殘液)。

2 結果與討論

2.1 ρ(樣品液)的測定

按1.2.1的方法操作，實驗結果見表1。由于提取濃縮液是生產過程中可以直接獲得濃度最高的喜樹堿水溶液，故此實驗中涉及的樣品溶液ρ(喜樹堿)，均為0.175 mg/mL。

表1 濃縮液中ρ(喜樹堿)

2.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附/解吸實驗

按1.2.3方法，實驗結果見表2。實驗結果表明，D402型與AB-8型大孔吸附樹脂對喜樹堿有較大的吸附容量；D101型樹脂次之； X-5與D201型樹脂吸附量差異不大。

表2 靜態(tài)吸附實驗結果

按1.2.3方法，結果見表3。

表3 靜態(tài)解析實驗結果

由表3可見，X-5的解吸率最高，但其吸附能力較差；AB-8和D402具有較高的吸附與解吸能力，均適用于喜樹堿的分離純化，從成本考慮，優(yōu)選AB-8型大孔吸附樹脂進行工藝研究。

2.3 大孔吸附樹脂純化喜樹堿工藝的研究

2.3.1 AB-8樹脂吸附時間對吸附性能的影響

吸附時間對吸附性能的影響結果見表4。

表4 吸附動力學實驗數據計算結果

實驗結果表明，吸附時間超過5 h，吸附量增長趨于平緩，吸附幾近飽和，所以確定吸附時間為5 h，吸附效果較好。

2.3.2 pH值對吸附性能的影響

pH值對吸附性能的影響結果見表5。

表5 pH值對樹脂吸附性能的影響

結果表明，在pH=4～8，隨著pH值增大，吸附容量也相應增加；當pH值大于8，吸附量有所下降，推測是喜樹堿鈉鹽具有易氧化分解的不穩(wěn)定性引起的，實驗確定pH值對吸附量的影響并不大，考慮到簡化工藝步驟，確定不調pH值上樣。

2.3.3 吸附透過曲線的繪制

將0.175 mg/mL喜樹堿樣品溶液，以2 BV/h的吸附流速過樹脂柱，HPLC測定流出液中ρ(喜樹堿)，以流出液體積為橫坐標，ρ(流出液)為縱坐標，繪制吸附透過曲線，結果見圖1。

流出液體積/BV圖1 喜樹堿的吸附透過曲線

由圖1所示，在吸附流速為2 BV/h的條件下，吸附溶液流經前18BV未發(fā)生泄露，從19BV開始，隨著流出液體積的增加，泄露率不斷增高，當流出液體積超過23BV，泄露曲線趨向平緩，表明樹脂吸附已經接近飽和，此時吸附量為20.48 mg/g。

2.3.4 φ(乙醇)對樹脂洗脫性能的影響

按1.2.4.4方法，結果見表6。實驗表明，隨著φ(乙醇)的升高，喜樹堿的洗脫率也不斷提高，體積分數95%的乙醇洗脫率最高，而且高φ(乙醇)進行洗脫，洗脫液便于濃縮，能夠減少回收水分帶來的目標物損耗，因此選擇φ(乙醇)=95%的乙醇為洗脫溶劑。

表6 φ(乙醇)對樹脂洗脫性能的影響

2.3.5 洗脫流速對樹脂洗脫性能的影響

按1.2.4.5方法，結果見表7。實驗結果表明，隨著洗脫流速的增大，洗脫率逐漸降低，而且根據經驗，洗脫流速通?？刂圃谖搅魉俚亩种槐容^理想，故選擇洗脫流速為1 BV/h。

表7 洗脫流速對樹脂洗脫性能的影響

2.3.6 大孔吸附樹脂的穩(wěn)定性研究

按1.2.4.6方法，實驗結果見表8。實驗結果表明，新樹脂和再生后的樹脂吸附率差別大，再生后的樹脂之間吸附率差別較小。

表8 樹脂使用次數對吸附率的影響

2.3.7 AB-8樹脂的最佳純化工藝

取700 mL提取濃縮液通過裝有30 mL AB-8濕樹脂的層析柱(20 mm×400 mm)，按上述選定的上樣、洗脫條件操作，每1BV收集一瓶，依次編號,GF254硅膠薄層點樣跟蹤，合并檢出項，HPLC測定流出液及ρ(洗脫液)，計算樹脂的吸附量和洗脫率，洗脫液經濃縮去醇，干燥后稱量，計算洗脫物中喜樹堿的純度，結果見表9。

表9 樹脂最佳工藝條件下動態(tài)性能參數

經GF254硅膠薄層點樣跟蹤，1～8號瓶在紫外光下，喜樹堿斑點可見，第9號瓶開始無喜樹堿檢出，合并1～8號瓶，HPLC測定洗脫液中ρ(喜樹堿)，在選定的上樣、洗脫條件下，φ(乙醇)=95%洗脫8BV，洗脫率可達83.1%，洗脫物中喜樹堿質量分數大于7%，說明AB-8大孔吸附樹脂對喜樹葉粗提液的凈化效果良好，效率高，工藝可行。

3 結 論

結合大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸實驗結果進行篩選，優(yōu)選出AB-8大孔吸附樹脂，并對樹脂的上樣、洗脫條件的相關參數進行考察，確定AB-8大孔吸附樹脂純化喜樹堿粗提液的最佳工藝為：將濃縮液不調pH值上樣，上樣流速2 BV/h，平衡吸附5 h；用體積分數95%的乙醇以1 BV/h流速進行洗脫，洗脫量為8BV。該條件下洗脫物中喜樹堿質量分數大于7%，通過對樹脂再生性能的考察，發(fā)現新樹脂吸附一次后，吸附率下降約30%，每次使用后需對樹脂進行系統(tǒng)地再生。

[ 參 考 文 獻 ]

[1] Hiang YH,Herizberg R,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I [J].Biol Chem,1985,260:14873-14878.

[2] 李善吉,伍勝君.大孔樹脂的應用概況[J].廣東輕工技術學院學報,2005,4(2):11-13.

[3] 劉彬果,郭文勇,鐘蕾,等.大孔樹脂吸附技術在中藥中的應用[J].解放軍藥學學報,2003,19(6):452-455.