垂直層疊結(jié)構(gòu)的LED誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)

楊曉博，閆衛(wèi)平

(1.許昌學(xué)院電氣工程學(xué)院，河南許昌 461000;2.大連理工大學(xué)電子科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024)

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垂直層疊結(jié)構(gòu)的LED誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)

楊曉博1,2，閆衛(wèi)平2

(1.許昌學(xué)院電氣工程學(xué)院，河南許昌 461000;2.大連理工大學(xué)電子科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024)

為進(jìn)一步減小光源的體積及簡化光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，消除毛細(xì)管電泳芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)中激發(fā)光源的反射光和雜散光的干擾，降低系統(tǒng)的檢測限，設(shè)計(jì)并建立了基于偏振隔離結(jié)構(gòu)的垂直層疊式發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)。整個(gè)系統(tǒng)由發(fā)光二極管光源、兩片線性偏振片、多通道毛細(xì)管電泳芯片、針孔、電荷耦合器件、高壓電源、數(shù)據(jù)采集卡及數(shù)據(jù)處理單元等組成。在系統(tǒng)條件最優(yōu)化的情況下，對羅丹明B樣品溶液進(jìn)行了毛細(xì)管電泳分離實(shí)驗(yàn)。

垂直層疊結(jié)構(gòu)；毛細(xì)管電泳芯片；熒光檢測；偏振片

0 引言

毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)芯片是微流控生物芯片的一種，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組分研究、藥物篩選、基因診斷等生化分析領(lǐng)域[1]。陣列CE芯片由于能夠同時(shí)對多種分析樣品進(jìn)行并行檢測，效率更高、成本更低，已成為生化分析領(lǐng)域前沿的研究熱點(diǎn)之一[2]。在利用CE芯片進(jìn)行生化分析的過程中，被測樣品的組分及含量等相關(guān)信息由檢測系統(tǒng)來測定。由于CE芯片中毛細(xì)管的內(nèi)徑一般為10 ～ 100 μm，樣品進(jìn)樣量極少，因而對檢測系統(tǒng)的靈敏度、分辨率及響應(yīng)速度都有較高的要求，檢測系統(tǒng)的性能將直接決定CE芯片分析系統(tǒng)的整體性能[3]。

如何濾除掉激發(fā)光的干擾，使到達(dá)檢測器的信號只包含有用的熒光信號，同時(shí)避免使用傳統(tǒng)共聚焦型激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)中體積較大的光學(xué)組件，已成為制約整個(gè)檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)微型化的瓶頸[4-6]。本文中提出了一種成本相對較低、通用性較強(qiáng)的毛細(xì)管電泳芯片檢測系統(tǒng)，系統(tǒng)以貼片式LED代替?zhèn)鹘y(tǒng)的半導(dǎo)體固體激光器作為光源，采用兩片偏振方向互相垂直的線性玻璃偏振片濾除掉激發(fā)光對檢測器的干擾，以線陣CCD為光電檢測器件，大大減小了檢測系統(tǒng)的體積，以羅丹明B溶液為樣品在最優(yōu)化條件下進(jìn)行電泳分離，得到了較高的檢測靈敏度。

1 檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

基于CCD及偏振片的LED誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。系統(tǒng)主要包括貼片式綠光LED激發(fā)光源，玻璃材質(zhì)的多通道毛細(xì)管電泳芯片，2片偏振方向互相垂直的線性偏振片，線陣CCD器件，數(shù)據(jù)采集卡及計(jì)算機(jī)等。其中，兩偏振片與毛細(xì)管電泳芯片成三明治結(jié)構(gòu)，偏振片1位于激發(fā)光源與毛細(xì)管電泳芯片之間，與偏振片1偏振方向垂直的偏振片2位于電泳芯片的上方，用于濾除激發(fā)光的干擾，只允許熒光信號通過。為限制檢測區(qū)域及提高檢測系統(tǒng)的信噪比，將不同尺寸的針孔置于偏振片2和CCD之間。CCD檢測到的熒光信號(峰值波長為580 nm)通過數(shù)據(jù)采集卡轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，利用USB總線與計(jì)算機(jī)連接，通過基于Visual C++ 6.0的編程軟件在計(jì)算機(jī)上實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集和顯示。

圖1 毛細(xì)管電泳芯片LED誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

2 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及實(shí)現(xiàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及元器件

實(shí)驗(yàn)過程中使用的化學(xué)試劑均為分析純級別。不同濃度的羅丹明B熒光染色劑樣品由10 mmol/L的固體樣品溶于無水乙醇中配制而成；緩沖液為由89 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、89 mmol/L的硼酸和2 mmol/L的EDTA用去離子水配制而成的混合溶液，pH值為8.3。光源采用貼片式綠光LED，激發(fā)波長峰值為532 nm；偏振片采用NT-66182型線性玻璃偏振片；數(shù)據(jù)采集卡12位，采樣頻率為20 MHz。

系統(tǒng)中使用的CCD為TCD1304AP型器件。該器件主要包括：光敏單元、2個(gè)移位寄存器、2個(gè)轉(zhuǎn)移柵電極、內(nèi)部驅(qū)動(dòng)信號邏輯電路和輸出信號緩沖電路[5]。其中，感光區(qū)位于中央位置，光敏陣列由光電二極管組成；感光單元中的前面32個(gè)及后面14個(gè)單元稱為啞元，沒有信號輸出，用Dn表示；中間的3 648個(gè)像素單元是有效的感光單元，用Sn表示。每個(gè)光敏單元的尺寸為8 μm × 200 μm。

2.2 毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

檢測系統(tǒng)中使用的四通道毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)如圖2所示。芯片通道單元結(jié)構(gòu)為基本的十字構(gòu)型，尺寸為40 mm ×80 mm，其中，微通道深60 μm，寬約100 μm(深40 μm處)，樣品進(jìn)樣通道長10 mm，分離通道長40 mm，相鄰兩分離通道間的距離為6 mm，十字交叉點(diǎn)處離檢測點(diǎn)的距離為30 mm，儲(chǔ)液池直徑為2 mm，容積約為5 μL。此外，設(shè)計(jì)的支撐網(wǎng)格起到更有效封接基片和蓋片的作用。

圖2 四通道毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 CCD驅(qū)動(dòng)電路及系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

電荷耦合器件在光電檢測領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用非常廣泛，為保證其在檢測過程中的測量精度、速度及抗干擾能力，有兩個(gè)主要問題需要解決：提供正常工作所需的時(shí)序驅(qū)動(dòng)信號及對輸出信號進(jìn)行處理。因此，CCD驅(qū)動(dòng)電路設(shè)計(jì)包括電源電路、時(shí)序驅(qū)動(dòng)電路及輸出信號調(diào)整電路的設(shè)計(jì)[7-9]。此外，為了對CCD器件的光積分時(shí)間進(jìn)行控制，還設(shè)計(jì)了4個(gè)光積分時(shí)間控制輸入端口。

根據(jù)系統(tǒng)功能的具體實(shí)現(xiàn)，軟件的設(shè)計(jì)主要包括上位機(jī)程序(PC機(jī)端USB設(shè)備的驅(qū)動(dòng)及相應(yīng)的檢測控制程序)和下位機(jī)程序(8051增強(qiáng)型單片機(jī)固件程序，以及保證芯片F(xiàn)X2模塊工作在Slave FIFO模式下的FPGA實(shí)現(xiàn))。FPGA程序設(shè)計(jì)使用Verilog HDL語言實(shí)現(xiàn)，在QUARTUS Ⅱ9.0平臺(tái)上完成程序的綜合、實(shí)現(xiàn)及下載，使用ModelSim軟件進(jìn)行仿真。數(shù)據(jù)采集程序在開發(fā)過程中使用微軟公司提供的Microsoft Function Class集成開發(fā)庫，主要實(shí)現(xiàn)向下位機(jī)發(fā)送命令，并負(fù)責(zé)接收下位機(jī)發(fā)送的數(shù)據(jù)，處理后實(shí)時(shí)繪制出檢測結(jié)果。

2.4 芯片電泳條件

每次電泳實(shí)驗(yàn)前，分別使用1 mol/L的NaOH溶液、去離子水和緩沖溶液清洗毛細(xì)管電泳芯片微通道。實(shí)驗(yàn)過程中使用如圖3所示的電動(dòng)進(jìn)樣模式進(jìn)行熒光染色劑羅丹明B樣品的進(jìn)樣，圖中B表示緩沖液池(Buffer reservoir),S表示樣品池(Sample reservoir),D表示檢測區(qū)域(Detection area),SW表示樣品廢液池(Sample waste reservoir)。進(jìn)行電泳操作前，首先取適量羅丹明B儲(chǔ)備液稀釋在無水乙醇中，配制成一定濃度的樣品溶液，然后將緩沖液和樣品加入各自的儲(chǔ)液池中。進(jìn)樣階段，樣品從樣品池(600 V)遷移至樣品廢液池，緩沖液池和緩沖廢液池的電壓分別為400 V和600 V，樣品廢液池電極接地。進(jìn)樣30 s后，高壓電源切換，十字交叉口處的樣品從進(jìn)樣通道進(jìn)入分離通道進(jìn)行分離及檢測，此時(shí)緩沖液池施加800 V電壓，樣品池和樣品廢液池電壓均為600 V，緩沖廢液池電極接地。每次電泳操作結(jié)束后，立即用去離子水清洗芯片微通道，以免緩沖溶液水分蒸發(fā)堵塞通道。

圖3 毛細(xì)管電泳芯片電動(dòng)進(jìn)樣和分離過程示意圖

3 測試結(jié)果與討論

3.1 LED光源的穩(wěn)定性

為了檢測LED光源的特性，在測試過程中使LED的驅(qū)動(dòng)電壓每3 min變化一次，變化范圍從3.0～4.2 V，步長為0.2 V，用以考察LED的驅(qū)動(dòng)電壓對其發(fā)光強(qiáng)度及穩(wěn)定性的影響。LED驅(qū)動(dòng)電壓與發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系如圖4所示，可以看出發(fā)光強(qiáng)度與驅(qū)動(dòng)電壓具有良好的線性關(guān)系，當(dāng)驅(qū)動(dòng)電壓恒定時(shí)光強(qiáng)穩(wěn)定。當(dāng)驅(qū)動(dòng)電壓達(dá)到4.2 V時(shí)，LED的發(fā)光強(qiáng)度在3 min內(nèi)急速地下降，這很大程度上是由于LED器件內(nèi)部陰極與陽極間的工作電流已經(jīng)超過它的上限，多余的焦耳熱導(dǎo)致了不可避免的器件損壞。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，LED的驅(qū)動(dòng)電壓恒定設(shè)置為4.0 V。

圖4 LED光源驅(qū)動(dòng)電壓與其發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系

3.2 偏振隔離程度對檢測結(jié)果的影響

該文利用NT-66182型線性玻璃偏振片進(jìn)行了偏振隔離程度的檢測，其在波長400 ～ 700 nm時(shí)的消光系數(shù)為10 000:1，兩偏振片平行放置時(shí)透光率為11%，垂直放置時(shí)為0.000 22%。實(shí)驗(yàn)過程中，保持LED驅(qū)動(dòng)電壓為4.0 V不變，偏振片1固定，使偏振片2的偏振角度從0°依次旋轉(zhuǎn)至360°，檢測結(jié)果如圖5所示。圖中的橫軸為兩偏振片之間的相對偏振角度，縱軸為透射的熒光信號相對強(qiáng)度，兩者呈余弦函數(shù)關(guān)系。由測試結(jié)果可以看出：采用偏振方向相互垂直的兩線性玻璃偏振片，可以將入射光完全濾除掉，使通過針孔到達(dá)光電轉(zhuǎn)換器件的信號只包含有用的熒光信號，提高了檢測系統(tǒng)的信噪比。

圖5 激發(fā)光相對光強(qiáng)與兩偏振片之間相對偏振角度的關(guān)系

3.3 針孔的濾波效果

為了進(jìn)一步提高系統(tǒng)的信噪比，降低噪聲信號對有用熒光信號的干擾，考慮在光電轉(zhuǎn)換器件前端放置針孔。為考察針孔直徑對檢測結(jié)果的影響，3種不同尺寸(直徑分別為0.5 mm、1 mm、2 mm)的針孔被置于CCD檢測器和偏振片2之間，LED的驅(qū)動(dòng)電壓為4.0 V，兩偏振片間的偏振角度為90°。圖6給出了1 mmol/L的羅丹明B樣品溶液注入毛細(xì)管電泳芯片同一通道時(shí)，在3種不同尺寸針孔下的檢測結(jié)果。

圖6 不同針孔直徑對系統(tǒng)檢測結(jié)果的影響

從圖中可以看出，檢測到的熒光信號強(qiáng)度隨著針孔尺寸的增大而增強(qiáng)。但是，當(dāng)針孔的尺寸較大時(shí)，其檢測到的熒光信號的譜峰寬度也較大，若此時(shí)被分離的樣品溶液含有多種組分，則不同組分的檢測峰有可能相互交疊，其中半峰寬較窄的波峰會(huì)被半峰寬較寬的波峰覆蓋，進(jìn)而導(dǎo)致無法準(zhǔn)確判斷樣品的組成。由圖中還可以看出，如果針孔直徑較小(0.5 mm)，樣品濃度較低時(shí)(1 μmol/L)熒光信號會(huì)很弱，甚至有可能檢測不到波峰，因此，檢測系統(tǒng)中針孔的直徑選定為1 mm。

3.4 檢測系統(tǒng)的性能

將4種不同濃度的羅丹明B樣品溶液(從1 mmol/L到1 μmol/L)分別注入毛細(xì)管電泳芯片的4條微通道，利用組建好的檢測系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離實(shí)驗(yàn)。其中，進(jìn)樣電壓和分離電壓分別為600 V和800 V。實(shí)驗(yàn)條件為：LED驅(qū)動(dòng)電壓為4.0 V，兩偏振片間的偏振角度為90°，針孔直徑為1 mm。得到的檢測結(jié)果如圖7所示，圖中的4條曲線從左至右分別代表4種濃度由小到大的樣品溶液電泳分離時(shí)檢測到的熒光信號強(qiáng)度，濃度越大，熒光信號越強(qiáng)。

圖7 4種不同濃度羅丹明B樣品溶液在優(yōu)化條件下的電泳分離結(jié)果

4 結(jié)束語

4 機(jī)械殼設(shè)計(jì)

由于在高壓環(huán)境進(jìn)行測試，電路板放置在機(jī)械封裝中，機(jī)械殼體采用全封閉組合電器用耐壓殼體，與外界的高壓環(huán)境隔絕，因此在殼體內(nèi)部的電路板仍然處于常壓狀態(tài)，外部的沖擊對電路板的性能以及其他的影響基本為0,所以在常壓下對電路板進(jìn)行的標(biāo)定是完全可以被用在高壓環(huán)境中的。裝置殼體尺寸是≤50 mm×100 mm的圓柱體，殼體設(shè)計(jì)為圓柱殼體較立方殼體有以下優(yōu)點(diǎn)：體積利用率高；相同材料下，圓柱殼體比立方殼體強(qiáng)度高；圓柱殼體360°對稱，而立方殼體每條棱和棱角處易出現(xiàn)應(yīng)力集中，使殼體變形或損壞。

5 結(jié)束語

本文中所介紹的小型高速采集系統(tǒng)裝置具有體積小可內(nèi)置的特性，在有限的體積、重量等設(shè)計(jì)約束下，實(shí)現(xiàn)了降低功耗，高性能，長使用時(shí)間的設(shè)計(jì)目標(biāo)，殼體達(dá)到了高壓條件下對系統(tǒng)的耐壓防漏要求，系統(tǒng)采集精度可達(dá)到±1.9 mV,速度可達(dá)500 MSPS,經(jīng)過測試得出系統(tǒng)比較穩(wěn)定，使用方便，能夠滿足設(shè)計(jì)和使用的要求。

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Vertical Multi-Layer LED-Induced Fluorescence Detection System

YANG Xiao-bo1,2,YAN Wei-ping2

(1.College of Electrical Engineering,Xuchang University,Xuchang 461000,China;2.School of Electronic Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

A cross-polarization scheme and vertical multi-layer structure was presented to filter out the excitation light from the emission spectrum of fluorescent dyes using green light emitting diodes as a light source and a linear charge coupled device as an intensity detector in order to decrease detection limit of the system.The detection system was composed of light emitting diode light source,two polarizers,capillary array electrophoresis microchip,pinhole,charge coupled device,high-voltage power supply,data acquisition card and data processing unit.Under optimal conditions,capillary electrophoresis separation test of Rhodamine B dye sample was conducted.

vertical multi-layer structure;capillary electrophoresis microchip;fluorescence detection;polarizer

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(132300410091)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13B510240)

2014-03-23 收修改稿日期：2014-10-05

TN29

A

1002-1841(2015)03-0066-03

姚琴琴(1989—)，碩士研究生，主要從事動(dòng)態(tài)測試與智能儀器的研究。E-mail:15035168176@163.com