丹參藥材指紋圖譜建立方法研究

崔同欣 劉 將 紀(jì)亞楠

丹參藥材指紋圖譜建立方法研究

崔同欣 劉 將 紀(jì)亞楠

（上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽阜陽(yáng)236018）

在目前已知的丹參及其制劑成分檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，主要對(duì)丹參水溶性成分的指紋圖譜建立方法進(jìn)行了初步探究，通過(guò)試驗(yàn)建立了丹參藥材水溶性成分指紋圖譜檢測(cè)的試驗(yàn)條件和方法。

丹參藥材；指紋圖譜；方法；建立

0 引言

丹參，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。秋季9—10月份采挖，除去泥沙，干燥。

丹參藥材中有效成分主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)為水溶性的酚酸類(lèi)成分（丹參素、原兒茶醛和丹酚酸A、B、C等），另一類(lèi)為脂溶性的二萜類(lèi)成分（丹參酮I、丹參酮II和隱丹參酮等）。定性鑒別上述兩類(lèi)成分或定量測(cè)定其某種或多種有效成分含量，已成為評(píng)價(jià)丹參及其制劑質(zhì)量的重要方法[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，丹參制劑達(dá)100多種，而丹參制劑中主要有效成分為水溶性的酚酸類(lèi)成分，考慮到原藥材的質(zhì)量控制與制劑質(zhì)量之間的相關(guān)性，我們主要對(duì)丹參藥材水溶性酚酸類(lèi)成分進(jìn)行了指紋圖譜的研究，該類(lèi)成分對(duì)紫外線具有較強(qiáng)的吸收值，可采用HPLC-UV法建立制劑指紋圖譜。

1 丹參指紋圖譜研究情況

1.1 脂溶性成分的指紋圖譜

丹參脂溶性成分的指紋圖譜，一般將藥材經(jīng)處理提取后，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。由于丹參藥材、對(duì)照品以及使用儀器等條件的不同，洗脫系統(tǒng)存在差異。徐德然[2]等以丹參酮ⅡA、隱丹參酮為對(duì)照進(jìn)行指紋圖譜研究。

目前獲取指紋圖譜的主要方法有色譜法、光譜法、X射線衍射法和分子生物技術(shù)等。其中，色譜技術(shù)是近年來(lái)分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展快、應(yīng)用廣的方法之一。常用的色譜技術(shù)包括薄層色譜、液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等[3]。其中，高效液相色譜是液相品，5%甲醇與0.1%乙酸-甲醇梯度洗脫，在254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，用于不同產(chǎn)地丹參脂溶性成分指紋圖譜的比較研究。

1.2 水溶性成分的指紋圖譜

近10年來(lái)，采用HPLC法分析技術(shù)對(duì)水溶性酚酸類(lèi)化合物進(jìn)行指紋圖譜研究有顯著的優(yōu)勢(shì)。研究中一般采用C18柱，甲醇或乙腈同時(shí)加入酸抑制劑進(jìn)行線性梯度洗脫，分離效果較佳。周欣[4]等以丹參素鈉、原兒茶醛為對(duì)照品，乙腈-0.4%冰醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，建立了貴州銅仁地區(qū)丹參藥材的HPLC水溶性共有指紋圖譜；宋敏[5]采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液梯度程序洗脫，以丹參對(duì)照藥材制備指紋對(duì)照品進(jìn)行了色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，并考察了梯度洗脫程序、流動(dòng)相酸度以及色譜柱填充劑對(duì)指紋圖譜重現(xiàn)性的影響。

1.3 有效成分的指紋圖譜研究

隨著丹參指紋圖譜研究的深入，丹參有效成分（脂溶性和水溶性）指紋圖譜的研究也日益成熟。鑒于藥材的有效成分理化性質(zhì)差異較大，實(shí)際操作中，多采用水提、不同濃度甲醇提取等方法，以含酸抑制劑的乙腈或甲醇為流動(dòng)相，建立丹參有效部位指紋圖譜定性研究的分析方法。

劉艷華[6]等采用水提法，以原兒茶醛為外標(biāo)，1%冰醋酸和1%冰醋酸甲醇溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，建立了河南靈寶地區(qū)丹參藥材的指紋圖譜；鄭曉珂[7]等以甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)281 nm，柱溫35 ℃，建立了丹參藥材的指紋圖譜；黎瓊紅[8]等采用甲醇為溶劑進(jìn)行索提后，以丹參酮ⅡA、原兒茶醛、丹參素鈉為對(duì)照品，0.02%磷酸乙腈-0.02%磷酸梯度洗脫，40 ℃柱溫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，建立了丹參藥材的高效液相指紋圖譜；劉洋[9]等采用水回流提取后甲醇超聲的方法，以丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮ⅡA為對(duì)照品，用0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃，在同一圖譜中同時(shí)建立起水溶性成分和脂溶性成分的指紋圖譜。

1.4 其他方法

近些年來(lái)，隨著毛細(xì)管電泳（HPCE）、高速逆流色譜（HSCCC）及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)已經(jīng)被用于丹參指紋圖譜的研究。

季一兵[10]等用毛細(xì)管電泳技術(shù)，采用50 μm× 50 cm未涂漬毛細(xì)管柱，20 mmol/L硼砂溶液作緩沖液，運(yùn)行電壓為15 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，建立了丹參中藥材的HPCE指紋圖譜；顧銘[11]等采用HSCCC法，以正己烷-乙醇-水體系采用分步洗脫，建立了丹參藥材中脂溶性成分的HSCCC指紋圖譜；陳勇[12]等應(yīng)用電噴霧-質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)研究了原兒茶醛和丹參素的ESI-MS規(guī)律，并對(duì)丹參藥材中已知的18種水溶性成分中的5種進(jìn)行了質(zhì)譜檢測(cè)和電噴霧行為探討，初步制定了丹參藥材的水溶性成分的特征圖譜。此外，汪紅[13]等以丹酚酸B為指標(biāo)，以0.5%甲酸-乙腈為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，得到其LC-MS（n）特征圖譜，同時(shí)對(duì)圖譜中7種主要化合物進(jìn)行了精確歸屬，初步探討丹酚酸成分的ESI-MS（n）規(guī)律。

徐曼[14]等還應(yīng)用對(duì)照品對(duì)照和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)丹參注射液中的主要成分進(jìn)行了定性分析，測(cè)定了18個(gè)不同廠家生產(chǎn)的丹參注射液的HPLC-UV指紋圖譜以及代表性廠家注射液的HPLC-DAD-MS圖譜，指認(rèn)了其中的15個(gè)酚酸類(lèi)成分，研究結(jié)果顯示，18個(gè)不同廠家生產(chǎn)的丹參注射液在所含化學(xué)成分的數(shù)目和含量上差異顯著。該方法可用于測(cè)定不同來(lái)源的丹參注射液的色譜指紋圖譜，并為丹參注射液的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)和生產(chǎn)工藝監(jiān)控提供了可行的方法。

2 丹參水溶性成分指紋圖譜建立方法試驗(yàn)

2.1 供試品溶液的制備

原藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究主要是為了更好地控制制劑的質(zhì)量，因而在藥材指紋圖譜的研究中，應(yīng)充分考慮藥材指紋圖譜控制與制劑質(zhì)量之間的相關(guān)性，故在供試品溶液的制備時(shí)，我們參考了制劑的制備工藝，即以一定濃度的堿水進(jìn)行提取。

2.1.1 丹參藥材的粉碎

丹參藥材需粉碎成細(xì)粉后進(jìn)行提取，粉碎前如藥材含水量較高，則應(yīng)將藥材低溫干燥，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010版丹參含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，藥材粉碎成過(guò)三號(hào)篩的藥材細(xì)粉即可，但我們?cè)诜鬯闀r(shí)發(fā)現(xiàn)有少量藥材纖維難以粉碎過(guò)三號(hào)篩，該部分應(yīng)盡量粉碎后加入藥材細(xì)粉混勻，再稱(chēng)取樣品，以保證取樣的均勻。

2.1.2 提取方式及溶劑的選擇

考慮到丹參注射劑制劑的制備工藝采用水提醇沉和堿水解的工藝，本藥材提取方法擬采用堿水提取。首先對(duì)提取方式及提取溶劑進(jìn)行了優(yōu)選：稱(chēng)取藥材粉末1.0 g，共6份，按表1進(jìn)行提取，提取時(shí)間為1 h，各提取液濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL，加入等體積甲醇，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，HPLC分析。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

考察了不同的提取時(shí)間對(duì)圖譜的影響：稱(chēng)取藥材粉末1.0 g，共3份，精密加入25 mL 0.08%Na2CO3溶液回流提取，提取時(shí)間按表3進(jìn)行，提取結(jié)束，取續(xù)濾液5 mL，加甲醇5 mL，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，

表1 提取方法優(yōu)選

結(jié)果顯示，以0.1%Na2CO3水溶液回流提取，效果較好，與中間體及制劑的色譜圖相對(duì)吻合，提示該提取溶劑較為適合。

為了更進(jìn)一步地優(yōu)選適宜的提取溶劑，以0.1% Na2CO3為參考，考察了多個(gè)不同濃度的Na2CO3水溶液：稱(chēng)取藥材粉末1.0 g，共8份，按表2進(jìn)行回流提取，提取時(shí)間為1 h，各提取液濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL，加入等體積甲醇，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，HPLC分析。

表2 提取方法優(yōu)選

結(jié)果顯示，以0.08%Na2CO3水溶液回流提取，樣品色譜峰與半成品及制劑的指紋圖譜吻合度相對(duì)較好，因此，最終選擇提取方式為0.08%Na2CO3水溶液回流提取。HPLC分析。

表3 提取時(shí)間選擇

藥材回流提取1 h及2 h，色譜峰差異較小，指紋圖譜的吻合度較好，考慮到節(jié)約時(shí)間，選擇提取回流時(shí)間為1 h。

藥材供試品溶液的制備確定為：稱(chēng)取丹參藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0 g，置具塞圓底燒瓶中，加0.08% Na2CO325 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，加0.08%Na2CO3補(bǔ)足失重，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 檢測(cè)方法選擇

考慮到藥材提取液中主要含水溶性的酚酸類(lèi)成分，并參考了丹參注射劑等制劑有效成分的檢測(cè)條件，選用HPLC-UV法進(jìn)行分析，具體的測(cè)試條件、方法考察如下：

2.2.1 儀器和試劑

HPLC儀器：Agilent 1100 G1311A QuartPump，VWD紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器，全自動(dòng)進(jìn)樣器，AgilentLC色譜工作站。

溶劑：甲醇為色譜純（漢邦科技有限公司），乙腈為色譜純（Tedia company），三氟乙酸、冰醋酸均為色譜純，水為亞沸蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2.2.2 流動(dòng)相選擇

（1）甲醇：酸水系統(tǒng)；（2）乙腈：酸水溶液系統(tǒng)。

試驗(yàn)優(yōu)選了兩種系統(tǒng)的流動(dòng)相條件（甲醇為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，酸水溶液為流動(dòng)相C），試驗(yàn)結(jié)果如表4～表8所示。

表4 梯度（1）

表5 梯度（2）

表6 梯度（3）

表7 梯度（4）

表8 梯度（5）

試驗(yàn)結(jié)果表明，在乙腈-酸水溶液系統(tǒng)下該制劑中整體色譜峰能呈現(xiàn)良好的分離，0.1%三氟乙酸水與0.5%冰醋酸水效果相當(dāng)，考慮到大部分丹參制劑含量測(cè)定中使用的酸水為0.5%冰醋酸水，因此指紋圖譜流動(dòng)相條件最終確定為梯度（5）的方法。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

對(duì)丹參樣品進(jìn)行了全波長(zhǎng)（190～400 nm）HPLC測(cè)試，結(jié)果顯示，在281 nm測(cè)定波長(zhǎng)下整體色譜峰較好，有效成分能夠充分體現(xiàn)，因此選擇測(cè)定波長(zhǎng)為281 nm。

2.3 色譜柱選擇

（1）C18柱：Hedera C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），江蘇漢邦科技有限公司；（2）C18柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特公司；（3）C18柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），菲羅門(mén)公司。

在上述條件下，3支以上規(guī)格C18色譜柱樣品的HPLC色譜圖均能達(dá)到分離要求，考慮簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的因素，我們選擇江蘇漢邦科技公司的Hedera C18色譜柱。

2.4 延時(shí)測(cè)試

丹參藥材供試液指紋圖譜延時(shí)測(cè)試，延長(zhǎng)測(cè)試時(shí)間1倍至2 h，藥材色譜圖中未見(jiàn)明顯的成分滯后峰，如圖1所示。

2.5 精密度試驗(yàn)

同一批丹參藥材供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行精密度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表9、表10所示。結(jié)果表明，供試液中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一批丹參藥材同法制備供試液6份，依法測(cè)定，結(jié)果分別如表11、表12所示。結(jié)果表明，供試液中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖1 丹參藥材供試液指紋圖譜延時(shí)測(cè)試

表9 丹參藥材樣品液的精密度考察結(jié)果（共有峰的相對(duì)保留時(shí)間）

表10 丹參藥材樣品液的精密度考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

表11 丹參藥材樣品液的穩(wěn)定性考察結(jié)果（共有峰的相對(duì)保留時(shí)間）

表12 丹參藥材樣品液穩(wěn)定性考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批丹參藥材同法制備供試品液6份，依法測(cè)定，結(jié)果分別如表13、表14所示。結(jié)果表明，供試品液中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件對(duì)多批制劑指紋圖譜進(jìn)行處理：從中選擇1張圖譜為對(duì)照?qǐng)D譜，對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配后生成“對(duì)照?qǐng)D譜”，將該圖譜作為本丹參藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖2所示。

2.8.2 丹參藥材指紋圖譜測(cè)定

表13 丹參藥材樣品液的重復(fù)性考察結(jié)果（共有峰的相對(duì)保留時(shí)間）

表14 丹參藥材樣品液重復(fù)性考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

2.8 丹參藥材指紋圖譜測(cè)定

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜制備

取19批丹參藥材，依法制備，分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定19批丹參藥材60 min指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)石家溝的丹參藥材圖譜有較大差異，所以將其舍去，考察剩余18批丹參藥材的相似度。

對(duì)以上各批丹參藥材以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為對(duì)照進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004B版》軟件進(jìn)行處理：以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為對(duì)照?qǐng)D譜，自動(dòng)匹配后，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果如表15所示。

結(jié)果顯示，以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為對(duì)照，18批藥材與之相似度均大于0.960，符合指紋圖譜要求。

圖2 丹參藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

表15 18批丹參藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，丹參藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制研究已較為深入，但仍有不足，特別是對(duì)于質(zhì)量控制要求較高的注射用制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高，主要包括對(duì)制劑中化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，建立合理的含量測(cè)定指標(biāo)，完善指紋圖譜等，從而為藥品的質(zhì)量控制、新產(chǎn)品的生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)、市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)、臨床合理用藥等方面提供有效的科學(xué)檢測(cè)方法和依據(jù)。本文主要對(duì)丹參水溶性成分的指紋圖譜建立方法進(jìn)行了初步探究，隨著檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步，必將有更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)和方法建立起來(lái)，以保障中藥及其制劑的質(zhì)量和使用安全。

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2015-05-04

崔同欣（1963—），男，安徽太和人，工程師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗(yàn)證工作。

劉將（1979—），男，安徽潁上人，藥師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗(yàn)證工作。

紀(jì)亞楠（1984—），女，安徽阜陽(yáng)人，助理工程師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗(yàn)證工作。