超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rg1和Re含量

陳小娟，李志紅，劉 靜，劉 賀

(北京以嶺藥業(yè)有限公司，北京 102600)

參松養(yǎng)心膠囊由人參、麥冬、山茱萸、丹參、赤芍、黃連等12味中藥組方，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)、清心安神功效。處方中以人參為君藥，其皂苷類成分為主要有效成分[1]?，F(xiàn)行質(zhì)量標準中人參皂苷Rg1和Re的含量測定采用高效液相色譜(HPLC)法[2]，但非常耗時，運行時間一般在90 min以上。本研究中應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC)法技術(shù)建立了參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC H－Class system液相色譜儀，包括四元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱及Empower3色譜工作站;ACQUITY ELSD蒸發(fā)光檢測器。人參皂苷Rg1對照品(批號為110703－201127)，人參皂苷 Re對照品(批號為 110754－201123)，均由中國食品藥品檢定研究院提供;參松養(yǎng)心膠囊(北京以嶺藥業(yè)有限公司);乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相:乙腈 －水，梯度洗脫(見表 1);流速:0.45mL/min;柱溫:35℃;進樣量:2 μL;ACQUITY ELSD檢測器條件:漂移管溫度為50℃，氣體流量為30.0 psi。理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計算應(yīng)不低于20 000。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

取本品30粒的內(nèi)容物，精密稱定，混勻，研細，取約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率160 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘渣加水30 mL溶解，用三氯甲烷振搖提取3次(30，20，20 mL)，棄去三氯甲烷液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖提取5次(25，25，25，15，15 mL)，合并正丁醇液，用氨試液洗滌 2 次(30，20 mL)，分取正丁醇液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(30，20 mL)，合并氨洗液和水洗液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(20，20，15 mL)，合并正丁醇提取液，并與上述正丁醇液合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，搖勻，作為對照品溶液。按處方工藝比例，自配不含人參的群藥，按工藝要求制成不含人參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

圖1 超高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

空白干擾試驗和系統(tǒng)適用性試驗:精密吸取2.2項下3種溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果，陰性對照品溶液色譜中，在與人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品相同保留時間處未見相應(yīng)色譜峰，故認為陰性無干擾。同時，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度為2.5，理論板數(shù)以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re計分別為97 988和100 711，滿足系統(tǒng)適用性要求。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察:取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.455 4 mg人參皂苷Rg1和0.415 3 mg人參皂苷Re的對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液 0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按擬訂色譜條件依法進樣測定。以色譜峰峰面積對數(shù)值(Y)為縱坐標、進樣量對數(shù)值(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，人參皂苷Rg1為 Y=0.368 X+3.755 4，r=0.999 1(n=6)，進 樣 量 在 0.091 08 ～1.135 8 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好;人參皂苷Re為 Y=0.372 X+3.812 1，r=0.999 2(n=6)，進 樣 量 在 0.083 06 ～1.038 25 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液(含人參皂苷Rg1 0.227 7 g/L，人參皂苷 Re 0.207 6 g/L)2 μL，連續(xù)進樣 6 次。結(jié)果峰面積的 RSD人參皂苷Rg1為0.91%(n=6)，人參皂苷Re為0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于 0，1，2，4，8，16，24 h時進樣2 μL，計算峰面積的 RSD值。結(jié)果的 RSD人參皂苷Rg1為 1.03%(n=7)，人參皂苷 Re 為 0.82%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批號(批號為1308030)的樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果含量的 RSD人參皂苷 Rg1為 1.06%(n=6)，人參皂苷 Re 為 0.88%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為1308030)6份，每份2 g，精密稱定，分別精密加入每1 mL含0.455 4 mg人參皂苷Rg1和0.415 3 mg人參皂苷 Re的對照品貯備液各2mL，按2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。樣測定，按外標兩點法對數(shù)方程計算供試品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量。結(jié)果見表3。

3 討論

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取10批樣品，每批2份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再分別按擬訂色譜條件依照UPLC法和HPLC法[2]進

UPLC法是以1.7 μm的超細色譜柱填料為核心的新興色譜分離技術(shù)[3]，改變的僅是色譜柱的粒徑大小，并未改變方法的分離原理[4]。本研究主要通過轉(zhuǎn)換流速、進樣量和流動相梯度條件:HPLC上1 mL/min流速轉(zhuǎn)換到UPLC上為0.45 mL/min;HPLC上15 μL的進樣量在UPLC上為2 μL;流動相梯度在HPLC[2]基礎(chǔ)上進行了調(diào)整，使在HPLC上90 min完成的分析在UPLC上用16 min即可完成。

UPLC法分離度、峰容量、分析速度、靈敏度和分辨率均較HPLC法有很大提高，與傳統(tǒng)的HPLC法相比，UPLC法的分析速度、靈敏度及分離度分別是HPLC法的9倍、3倍及2倍;在相同色譜條件下，UPLC法能分出更多的色譜峰[5]。HPLC法同時測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量一般需1 h以上時間，樣品組分才能得到較好地分離。本研究所建立的UPLC法僅需16 min即可完成參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定，分析速度提高了5倍以上，大大減少了溶劑損耗和廢液處置費用，減少了環(huán)境污染，降低了分析成本。同時，該方法可用于參松養(yǎng)心膠囊人參提取物及中間產(chǎn)品中人參皂苷Rg1和Re含量檢測的內(nèi)控，以縮短檢驗周期，減少物料庫存和中間產(chǎn)品的積壓，提高生產(chǎn)效率，起到節(jié)能降耗的作用。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

本研究中還考察了將HPLC用大顆粒色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)直接連接到 UPLC 上，按照 HPLC 法測定條件[2]進行測定。結(jié)果表明，HPLC法的測定條件可直接用于UPLC上，測定結(jié)果與HPLC法測定結(jié)果一致。

[4]，本研究中還曾采用紫外檢測器取代蒸發(fā)光檢測器進行了含量測定摸索試驗。檢測波長為203 nm，梯度洗脫條件略有改動，其他條件均采用本研究中建立的UPLC－ELSD方法。結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度為2.2，理論板數(shù)以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re計分別為276 215和381 460?？梢姡琔PLC－UV法也可用于參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量測定。但由于參松養(yǎng)心膠囊質(zhì)量標準為《中國藥典》[2]法定標準，同時，不同檢測器檢測信號存在差異，為了盡可能地減少企業(yè)內(nèi)控標準與法定標準的差異，本研究未將參松養(yǎng)心膠囊人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的UPLC－UV含量測定方法納入企業(yè)內(nèi)控標準，也未進行更深入的方法學(xué)研究。

參考文獻:

[1]莫炫永.HPLC測定參松養(yǎng)心膠囊中人參皂苷Rb1的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(12):112－114.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版·第二增補本[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2013:51－53.

[3]謝耀軒，林亞珠.超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27(5):489－493.

[4]楊立偉，鄭傳奇，蔣忠軍，等.超高效液相色譜法測定西洋參中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量[J].中藥材，2008，31(1):55 － 57.

[5]顏 梅，李詒光，趙 明，等.超高效液相色譜在中藥含量測定中的運用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(11):176－178.