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    一株水產(chǎn)益生菌的鑒定及其凈水研究

    2015-06-06 00:22:33姜文聯(lián)
    現(xiàn)代畜牧科技 2015年7期

    王 軍,姜文聯(lián)

    (廣東科貿(mào)職業(yè)學院動物科技系, 510640)

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    一株水產(chǎn)益生菌的鑒定及其凈水研究

    王 軍,姜文聯(lián)

    (廣東科貿(mào)職業(yè)學院動物科技系, 510640)

    鑒定1株分離自刺參養(yǎng)殖水體的益生菌DR1,進行了常規(guī)生理生化及16S rRNA基因序列分析,將DR1鑒定為馬氏副球菌。進一步研究了該益生菌水質(zhì)凈化能力,結(jié)果表明:該菌株能有效降低水體化學耗氧量(COD),減少氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量。

    益生菌;16S rRNA基因;生物學鑒定;凈水研究

    隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展,大規(guī)模、集約化的養(yǎng)殖模式逐漸取代了粗放、半粗放、半精養(yǎng)的養(yǎng)殖模式。集約化養(yǎng)殖過程中天然餌料已經(jīng)不能完全滿足養(yǎng)殖生物生長的需要,必須補充投喂人工配合飼料,以保證養(yǎng)殖生物的快速生長。不科學的投喂和管理模式使得飼料的利用率低下,沒有被養(yǎng)殖生物攝食的殘餌以及糞便等有機物沉入養(yǎng)殖池底,從而造成水體中營養(yǎng)物質(zhì)和有機物大量積累,在水體溶氧不足的情況下經(jīng)不完全氧化轉(zhuǎn)化為對養(yǎng)殖生物有毒有害的氨氮及亞硝酸鹽等物質(zhì),進而引起養(yǎng)殖生物中毒或死亡。

    水產(chǎn)益生菌通過氨化、氧化、硝化、反硝化和固氮等作用[1],將養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的殘餌、糞便以及水體中其他的有害物質(zhì)等迅速地分解為二氧化碳、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等無毒無害的營養(yǎng)物質(zhì)來達到凈化水質(zhì)的目的,在此過程中水體的溶解氧也得到了提高,以此保證養(yǎng)殖水環(huán)境的潔凈,從而促進養(yǎng)殖生物的健康生長。由于其綠色環(huán)保、不產(chǎn)生抗性、無毒副作用、無殘留污染、無記憶性、作用范圍廣等優(yōu)點目前已廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

    從刺參養(yǎng)殖池塘水體中分離篩選出1株海洋益生菌DR1。然后采用常規(guī)的生理生化方法和細菌16S rRNA基因序列測定,進行了該菌株的生物學分類鑒定,并在實驗室條件下研究了該菌株對養(yǎng)殖污水中COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解能力。

    1 材料與方法

    1.1 待測菌種及培養(yǎng)基

    菌株DR1分離自刺參養(yǎng)殖池塘水體中。選用2216E海水培養(yǎng)基:酵母膏 1g,蛋白胨 5g,F(xiàn)ePO40.1g,陳海水 1 000mL,pH=7.6~7.8,瓊脂 2%。

    1.2 形態(tài)學鑒定

    將兩菌株分別接種于2216E固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)24h 后,觀察平板上的菌落形態(tài)及表面特征,常規(guī)的檢驗還包括革蘭氏染色、芽孢染色、菌體運動性觀察以及形態(tài)觀察,具體方法和步驟參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《微生物學實驗技術(shù)》[2-3]。

    1.3 生理生化指標測定

    測定菌株DR1的生理生化特性,具體鑒定內(nèi)容及方法參照武心華《刺參池塘有機物降解菌固定化及其對水質(zhì)凈化作用研究》[4]進行。

    1.4 待測菌株的16S rRNA基因序列鑒定和分析

    1.4.1 PCR模板制備

    將細菌接種在平板上,28℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于50 L無菌蒸餾水中,于100℃水浴加熱5min,離心,取上清作為PCR模板DNA。

    1.4.2 16S rRNA基因的PCR擴增與測序

    以細菌16S rDNA擴增常用引物27F(5'-A G A G T T T G A T CC T G G C T CA G -3')和1492R(5'-A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T -3')為PCR引物。 采用50μL的反應體系,擴增模板DNA,并交由相關測試公司(北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司)進行序列測定。

    1.4.3 16S rRNA基因的序列分析及數(shù)據(jù)處理

    將菌株 DR1的 16S rRNA基 因序列與從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得的細菌的16S rRNA基因序列進行比對,采用ClustalX、BioEdit和MEGA4.1等軟件對菌株DR1進行系統(tǒng)進化分析,用Neighbor-Joning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,1000次RePlications,計算Bootstrap值評估樹的置信度,對DR1進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

    1.5 水質(zhì)凈化研究

    將經(jīng)過2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期的DR1培養(yǎng)液離心收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌2次后重懸作為水質(zhì)凈化研究的接種菌液,并用血球計數(shù)板計數(shù)菌濃度。本實驗按施用終濃度1.0×l06cfu/mL接種于盛有3L養(yǎng)殖污水的三角瓶中,以不加菌的處理作為對照組,每個處理設5個重復,每天定時取樣測定水體中COD、氨氮及亞硝酸鹽含量,連續(xù)監(jiān)測一周。水體中COD、氨氮、亞硝酸鹽測定方法參照照雷衍之《養(yǎng)殖水環(huán)境化學實驗》[5]進行。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

    熒光顯微鏡下DR1菌體呈球狀,無鞭毛,無芽孢,2216E平板上培養(yǎng)48~72h,肉眼觀察菌落呈橘黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊、表面較濕潤光滑。

    2.2 生理生化指標測定結(jié)果

    菌株DR1生理生化鑒定結(jié)果見表1。

    表1 菌株生理生化特性

    可以看出,該菌株為低溫種,在水溫超過25℃,菌體生長明顯受到抑制,最適生長溫度10~18℃。DR1對鹽度的適應范圍較廣,在0~4%的水體中均能正常生長。

    2.3 16S rRNA 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    將菌株DR1的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對,發(fā)現(xiàn)與該菌株序列同源性最高的絕大多數(shù)為副球菌屬的細菌,選取相關菌株的16S rRNA序列用Neighbour-Joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。如圖1所示,菌株DR1與副球菌屬的Paracoccus marcusii(EF491972)序列相似性達99%以上,結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性,將菌株DR1初步鑒定為馬氏副球菌。

    圖1 DR1的16S rDNA 基因序列聚類分析結(jié)果

    2.4 DR1凈水結(jié)果

    菌株DR1對水體中COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解效果見圖2。

    圖2 DR1對水體COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解

    由圖2可以看出,與對照組相比,施加DR1可以明顯降低養(yǎng)殖廢水中的化學耗氧量(COD),間接提高水體中溶解氧供養(yǎng)殖生物呼吸作用。同時,添加DR1的處理組,氨氮1周內(nèi)由0.9mg/L迅速降低到0.15mg/L,達到安全濃度;而水體中的亞硝酸鹽也由0.3mg/L降低到0.05mg/L,而對照組2個指標在此過程中均有所上升。

    3 討論

    根據(jù)常見細菌的鑒定方法,菌株DR1屬于革蘭氏陰性球狀菌;菌株好氧,無運動能力;接觸酶、氧化酶陽性;不產(chǎn)芽孢;不能利用檸檬酸鹽,硝酸鹽還原陽性。具有上述顯著特征的代表是副球菌屬菌株。

    16S rRNA作為一種重要的核酸水平鑒定工具,其顯著特點就是能及時鑒定出生長緩慢或生化惰性、細菌培養(yǎng)陰性以及非常規(guī)的菌株[6]。近年來,大量細菌的16S rRNA序列已被檢測并被NCBI等國際基因數(shù)據(jù)庫收錄,成為目前細菌鑒定和分類的主要參照系統(tǒng),并得到NASA、FDA、TIGR、NIAID等多個國際權(quán)威機構(gòu)的認可[7-8]。從16S rRNA基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上看,菌株DR1與Paracoeeus marcusii聚為一群,具有最高的相似性。從形態(tài)、生理、生化、系統(tǒng)發(fā)育學、16S rRNA基因序列同源性等方面分析,菌株DR1可鑒定為馬氏副球菌。

    水中氨態(tài)氮含量增加會抑制魚體內(nèi)的氮排泄,損害養(yǎng)殖生物鰓等器官組織,消耗水中溶解氧;亞硝態(tài)氮毒性較強,是養(yǎng)殖水域中誘發(fā)暴發(fā)性疾病的重要因素,因此去除水體中過量的氨氮、亞硝態(tài)氮對于改善水質(zhì)、提高養(yǎng)殖生物成活率和生長率、保護環(huán)境等具有重要意義。水體有益微生物能通過降低水體中有機物含量,以及一系列的消化、反硝化作用,降低水體中氨氮、亞硝酸鹽的含量,提高水體溶氧,是進行養(yǎng)殖生態(tài)防治重要手段。本文在實驗室條件下,研究了DR1對養(yǎng)殖污水的凈化能力,結(jié)果顯示,在小水體中,DR1對水體化學耗氧量(COD)、氨氮、亞硝酸鹽均有較好的降解能力,可以作為商業(yè)微生態(tài)制劑開發(fā)材料。

    [1] 馮俊榮,陳營,付學軍,等. 微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體水質(zhì)條件的影響[J].海洋湖沼通報,2005,(4):104-108.

    [2] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001:349-370.

    [3] 林連祥, 路福平. 微生物學實驗技術(shù)[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2006:25-31.

    [4] 武心華. 刺參池塘有機物降解菌固定化及其對水質(zhì)凈化作用研究[D]. 青島:中國海洋大學, 2011.1-76.

    [5] 雷衍之. 養(yǎng)殖水環(huán)境化學實驗[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

    [6] 劉朝軍. 16SrDNA 序列測定在細菌鑒定中的應用[J]. 軍醫(yī)進修學院學報, 2011,32(7):774-777.

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