S基因進(jìn)化樹分析證實(shí)乙型肝炎病毒存在性傳播途徑

李康 ，顏和芳 ，趙蔚 ，羅藝 ，徐文莉 ，廖長征 ，張洪德

(1、龍崗中心醫(yī)院，深圳 龍崗518116；2、寶安區(qū)慢性病防治院，深圳 寶安518126)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，我國是HBV高流行區(qū)，約9.7%的人為HBV攜帶者[1]。乙型肝炎病毒(HBV)性傳播途徑已研究多年并被基本證實(shí)[2，3]，但既往研究主要基于宏觀流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚未找到人與人之間HBV性傳播的確切證據(jù)。近年來，隨著分子流行病學(xué)的發(fā)展，越來越多的傳染病傳播途徑通過分子進(jìn)化分析在分子水平得到證實(shí)[4]。本研究選擇疑似發(fā)生HBV性傳播的夫妻，使用基因序列比對及基因進(jìn)化樹分析等分子流行病學(xué)方法分析其所染HBV S基因，試圖從分子水平證實(shí)HBV存在性傳播途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 從2010年來深圳市龍崗中心醫(yī)院體檢科做婚檢的夫妻中按照乙肝表面抗原結(jié)果篩選出女方陽性而男方陰性的夫妻36對，除5對男方注射乙肝疫苗而乙肝表面抗體陽性外，其余31對夫妻中男方乙肝兩對半均為全陰性。對這31名男性乙肝表面抗原每年隨訪檢測一次，至2014年，其中10名男性乙肝表面抗原由陰性變?yōu)殛栃?，且期間夫妻雙方均無輸血史。此10對夫妻作為病例組，女方使用一次性無菌采樣管采集陰道分泌物標(biāo)本，每管加入無菌生理鹽水1ml，震蕩混勻，分別標(biāo)記為W1-W10，-80℃保存；男方采集靜脈血分離血清，分別標(biāo)記為H1-H10，-80℃保存。另外隨機(jī)選擇10名來深圳市龍崗中心醫(yī)院感染科就診的血HBV-DNA陽性的男性乙型肝炎患者與上述10夫妻中女方隨機(jī)配對作為對照組，采集其靜脈血分離血清，分別標(biāo)記為U1-10，-80℃保存。病例組與對照組年齡、體重均無顯著性差異。

1.2 DNA提取 解凍陰道分泌物和血清標(biāo)本。陰道分泌物充分震蕩混勻后，吸取1ml至1.5ml離心管中，12000r/min離心5min，吸棄上清液，每管保留50μl上清液，勿觸及底部細(xì)胞團(tuán)，重新漩渦震蕩后備用。向50μl陰道分泌物、血清標(biāo)本中分別加入150μl含0.5%十二烷基磺酸鈉 (SDS)，1mg/ml蛋白酶 K，2.5mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)，25mmol/l醋酸鈉的裂解液，68℃裂解2h后，用苯酚、氯仿、異戊醇法提取HBV-DNA[5]。

1.3 基因測序及序列比對 針對乙肝病毒S基因設(shè)計(jì)巢式PCR引物。外引物1位于HBV基因序列的nt842-822(5’TTAGGGTTTAAATGTATACCC3’)，外引物 2 位于 nt56-76(5’CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC3’)，擴(kuò)增片 段 為 787bp。 內(nèi) 引 物 1位 于 nt427-448(5’CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG3’)， 內(nèi) 引 物 2 位 于nt687-668(5’GGCACTAGTAAACTGAGCC3’)。 使用ABI7500 PCR儀進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段為261bp。第一輪PCR產(chǎn)物1:50稀釋后作為第二輪PCR的模板，每輪PCR均設(shè)置陽性、陰性對照，PCR方法參考王珊珊等報(bào)道[6]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行高通量測序。使用DNAstar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行多序列比對及基因進(jìn)化樹繪制[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對病例組和對照組的基因序列相似性進(jìn)行比較。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV S基因序列比對結(jié)果顯示病例組S基因序列相似性高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表 1。

表1 病例組與對照組HBV S基因序列相似性比較(s)

表1 病例組與對照組HBV S基因序列相似性比較(s)

組別 數(shù)量 序列相似性病例組對照組t值P值10 10 0.9961±0.0019 0.9774±0.0051 10.89<0.05

2.2 基因進(jìn)化樹分析 基因進(jìn)化樹顯示H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9 分別處于同一獨(dú)立遺傳分支，存在非常密切的同源進(jìn)化關(guān)系。H8-W8-U3，H10-W10-U5分別處于同一獨(dú)立遺傳分支，說明H8-W8，H10-W10存在較密切同源進(jìn)化關(guān)系，但其相互間序列相似性并不比無關(guān)感染者U3，U5 高。H1-W1，H2-W2，H4-W4 均不在同一獨(dú)立遺傳分支，同源進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。見圖1。

圖1 30例患者HBV S基因進(jìn)化樹分析

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代流行病學(xué)的飛速發(fā)展，乙型肝炎的流行病學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入了分子流行病學(xué)時(shí)代。使用基因序列差異評估，種系發(fā)育分析等分子流行病學(xué)手段，可在分子水平對乙型肝炎病毒的不同傳播途徑予以證實(shí)。

本研究中病例組女性選擇陰道分泌物標(biāo)本，巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示10名女性HBV-DNA均呈陽性，說明病例組女性患者陰道分泌物具有傳染性，具備通過性途徑傳播HBV的潛在可能。由于HBV的DNA聚合酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，缺少3′→5′核酸外切酶活性(此酶可切除不合理插入的核苷酸)，因而缺乏校正的功能，且HBV復(fù)制產(chǎn)量高，可達(dá)1012-1013病毒顆粒/天，因而導(dǎo)致HBV DNA復(fù)制中錯(cuò)誤發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他DNA病毒，約為每個(gè)位點(diǎn)每年核

苷酸替代率1.4~3.2×10-5[8-10]。如此高的錯(cuò)誤發(fā)生率造成HBV的高變異率，也導(dǎo)致不同感染者體內(nèi)HBV-DNA序列存在一定差異，且序列差異隨著傳染距離的增長而增大。鑒于本研究病例組選擇為疑似性傳播病例，已基本排除男方由其他途徑感染HBV的可能，因此病例組中女方與其丈夫所感染HBV S基因序列相似性顯著高于病例組中女方與隨機(jī)選擇的無關(guān)男性乙肝患者HBV S基因序列相似性，可在分子水平證實(shí)病例組中男方所感染HBV由其配偶傳染而來。

對參與研究的30名患者HBV S基因序列做基因進(jìn)化樹分析進(jìn)一步揭示了病例組、對照組間HBV更為詳細(xì)的同源進(jìn)化關(guān)系。10對病例組中，有 5 對(H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9)處于同一個(gè)單獨(dú)的遺傳分支中，特別是H6-W6兩人HBV S基因序列完全相同，顯示出非常密切的同源進(jìn)化關(guān)系，證實(shí)這5對患者中，男方所染HBV由女方即其妻子傳播而來。H8-W8-U3，H10-W10-U5分別處于同一獨(dú)立遺傳分支，顯示出H8-W8，H10-W10間HBV較密切的同源進(jìn)化關(guān)系，但其相互間序列相似性并不比H8-U3，H10-U5高，說明 H8，H10所染 HBV可能由 W8，W10傳播而來，但幾率與從其他無關(guān)傳染源傳播而來無顯著差異。H1-W1，H2-W2，H4-W4雖然進(jìn)化距離較近但均不在同一獨(dú)立遺傳分支，其中H1與W7，H7在同一個(gè)獨(dú)立遺傳分支，W2與U7在同一個(gè)獨(dú)立遺傳分支，W4與U8，U9在一個(gè)獨(dú)立遺傳分支，說明H1-W1，H2-W2，H4-W4間HBV存在一定的同源進(jìn)化關(guān)系，但相互間同源進(jìn)化關(guān)系較H1-W7，W2-U7，W4-U8間同源進(jìn)化關(guān)系更遠(yuǎn)，故認(rèn)為H1，H2，H4 所染 HBV 可能不是從 W1，W2，W4 傳播而來。HBV S基因進(jìn)化樹分析進(jìn)一步從分子水平證實(shí)10對疑似性傳播HBV夫妻中5對存在夫妻間HBV傳播。

綜合序列比對和基因進(jìn)化樹分析結(jié)果，可以證實(shí)HBV存在夫妻間傳播，10對夫妻中，5對夫妻中男方所染HBV由女方傳播而來。鑒于本研究中女方選擇的標(biāo)本為陰道分泌物標(biāo)本，且既往研究也證實(shí)雖然HBV攜帶者唾液中可檢出HBVDNA[11-13]，但HBV并不通過共用餐具，擁抱，接吻，握手，咳嗽，噴嚏等途徑傳播[14，15]，因而排除了夫妻間通過其他非性途徑傳播的可能性，進(jìn)一步證實(shí)5對發(fā)生HBV夫妻間傳播的病例中男方所染HBV由女方通過性途徑傳播而來。從而最終從分子水平證實(shí)HBV可經(jīng)性途徑傳播。當(dāng)然本研究僅證實(shí)HBV感染女性可通過性途徑將HBV傳染給健康男性，男性HBV攜帶者是否也可將HBV通過性途徑傳染給女性或者男性性伴侶尚需要進(jìn)一步的深入研究來證實(shí)。

HBV的性傳播途徑雖早已通過大量流行病學(xué)研究及少量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得證實(shí)，但人與人之間HBV性傳播的直接證據(jù)卻一直難以獲得。本文使用分子流行病學(xué)方法首次在分子水平證實(shí)了人與人之間性傳播途徑的存在，顯示出基因序列比對，基因進(jìn)化樹分析等分子流行病學(xué)手段在研究傳染性疾病傳染源和傳播途徑方面的巨大價(jià)值，為大量已知傳染病傳染源和傳播途徑的精確分析和分子水平證實(shí)以及新發(fā)現(xiàn)傳染病傳染源與傳播途徑的快速確定提供了強(qiáng)大的研究工具。當(dāng)然此方法也存在一定的局限性。其主要局限性在于研究的病原體應(yīng)屬于變異率較高的高變異病原體，對于變異率較低的病原體，由于其不同感染者所帶病原體基因序列差異較小，是否能通過序列比對和基因進(jìn)化樹分析確定其傳染源和傳播途徑仍有待進(jìn)一步深入研究。

本研究從分子水平證實(shí)HBV存在性傳播途徑，可經(jīng)性途徑由女性傳染給男性。女性HBV感染者的健康性伴侶是HBV感染的高危人群，對此類高危人群的HBV預(yù)防不僅要及時(shí)接種乙肝疫苗并定期監(jiān)測乙肝表面抗體，還要加強(qiáng)安全性行為的教育，倡導(dǎo)使用避孕套，以阻斷HBV的性傳播途徑。

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