新疆傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的篩選鑒定及菌相分析

楊 潔,張文亮,鄒建軍,胡 敏,袁雪林,劉云國

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046)

新疆傳統(tǒng)酸奶中乳酸菌的篩選鑒定及菌相分析

楊 潔,張文亮,鄒建軍,胡 敏,袁雪林,劉云國*

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046)

酸奶是新疆各少數(shù)民族經(jīng)常食用的一種乳制品。從新疆采集的22個(gè)酸奶樣品中共分離出56株乳酸菌,通過形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)鑒定方法,結(jié)合16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,新疆傳統(tǒng)酸奶中菌相構(gòu)成為德氏乳桿菌(Lactobacillus.delbrueckiisubsp.)46株(占總分離株的82%);發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus.fermentum)2株(4%);瑞士乳桿菌(Lactobacillus.helveticus)2株(4%);嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)1株(2%);雞乳桿菌(Lactobacillus.gallinarum)2株(4%);屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)1株(2%);耐久腸球菌(Enterococcuscanis)2株(4%)。說明新疆傳統(tǒng)酸奶中德氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。

新疆傳統(tǒng)酸奶,乳酸菌,菌相,16S rDNA序列分析

乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1]。這類細(xì)菌在自然界分布廣泛,在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域中應(yīng)用價(jià)值很高。目前至少可分為18個(gè)屬,共有200多種。除極少數(shù)外,其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群,廣泛存在于人體的腸道中。新疆地域遼闊,自然環(huán)境和氣候差異都很大,新疆農(nóng)牧民制作酸奶的經(jīng)驗(yàn)豐富、歷史悠久,乳酸菌資源具有無可比擬的生物多樣性和基因多樣性[2-4]。因而,篩選鑒定新疆傳統(tǒng)酸奶中的乳酸菌并分析其菌相構(gòu)成具有重要的意義。

生理生化實(shí)驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是一種常見的細(xì)菌鑒定方法,每一種細(xì)菌的生命活動(dòng)和新陳代謝都是獨(dú)一無二的,他們的新陳代謝活動(dòng)和其代謝產(chǎn)物也不盡相同[5-7]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,16S rDNA序列測(cè)定技術(shù)也應(yīng)用到了細(xì)菌的鑒定及菌相構(gòu)成分析中[8-11]。細(xì)菌的16S rDNA基因大小適中,既含有高度保守序列,也具有相當(dāng)?shù)淖儺悈^(qū),是一種簡單、快速的在種、屬水平上鑒定大量菌株遺傳關(guān)系的方法,通過構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹,能夠較好地反映出屬、種分類地位和系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系,為細(xì)菌種屬鑒定和近緣種研究提供可靠依據(jù)[12]。

本研究從新疆喀什地區(qū)采集的22個(gè)酸奶樣品中共分離得到56株乳酸菌,通過形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)鑒定方法,結(jié)合16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定和分類,分析了新疆傳統(tǒng)酸奶中的菌相構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采集自喀什及周邊地區(qū)農(nóng)牧民家中,其中采自喀什市的樣品7份、阿圖什市4份、塔什庫爾干縣11份,共計(jì)22份樣品。利用樣品無菌采集管采集酸奶樣品,每一樣品分3份于冰盒保存,12小時(shí)內(nèi)送于實(shí)驗(yàn)室-70℃保存,備用。

過氧化氫,盧戈氏碘液,結(jié)晶紫,番紅,95%乙醇,吲哚試劑,溴甲酚紫;MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、MC固體培養(yǎng)基、M17固體培養(yǎng)基以及糖發(fā)酵基本培養(yǎng)基;無抗生素脫脂奶粉 新疆喀什南達(dá)乳業(yè)。

超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;HZQ-X100培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;高速冷凍離心機(jī) 力康有限公司;SpectrumLab53紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;C100S型PCR儀 美國Bio-Rad公司;pHS-25型pH計(jì) 上海精科雷磁有限公司。

1.2 樣品的活化

在篩選乳酸菌之前需要將樣品活化。按酸乳發(fā)酵條件活化樣品,即以3%的接種量將樣品加入12.5%(w/v)的脫脂乳中,42℃發(fā)酵4～6h,待酸乳凝固后按上述條件進(jìn)行二次發(fā)酵后待用。

1.3 乳酸菌的篩選及純化

首先將活化的樣品稀釋涂布,取10mL樣品加入到90mL無菌生理鹽水中,形成10-1的稀釋液,隨后從中取出1mL加入9mL生理鹽水管中形成10-2的稀釋液,之后依次稀釋成10-3、10-4、10-5的稀釋液。分別取0.1mL的稀釋液涂布于加有2%(w/v)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基和M17培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫培養(yǎng)48h,挑取有融鈣圈的單菌落進(jìn)行劃線純化。

1.4 生理生化及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

篩選及純化的菌株進(jìn)行吲哚實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[1]、《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[13]和《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[14]進(jìn)行鑒定。

1.5 乳酸菌的發(fā)酵以及感官實(shí)驗(yàn)

對(duì)分離得到的單菌落接入到12.5%的脫脂乳中,發(fā)酵4～6h后移入4℃放置6～8h后熟,對(duì)其凝乳狀態(tài)和感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 乳酸菌DNA的提取

DNA提取按照試劑盒說明書(Beijing Solarbio)的要求操作,略有改動(dòng),第二步添加了溶菌酶,用以乳酸菌破壁。

1.7 乳酸菌16S rDNA PCR擴(kuò)增

乳酸菌16S rDNA PCR擴(kuò)增體系見表1。引物采用細(xì)菌通用擴(kuò)增引物,正向引物27f:(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),反向引物1492r:(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。

擴(kuò)增循環(huán)為94℃ 5min,預(yù)變性;94℃(1min)、58℃(1min)、72℃(2min),35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增完畢后,取3μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL loading buffer混合點(diǎn)樣,用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),若PCR成功則在1500bp左右可見清晰條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物送寄于上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 16S rDNA PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system of 16S rDNA

1.8 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

代表性菌株的16S rDNA序列通過BLAST獲取與所測(cè)序列相似度最高的序列,ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì),利用聚類分析軟件Mega 5,采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及菌落特征

在加有2%(w/v)碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基和M17培養(yǎng)基上挑取有明顯融鈣圈的菌落,進(jìn)行純化,共得到56株乳酸菌,實(shí)驗(yàn)菌經(jīng)染色后,在油鏡下觀察呈現(xiàn)藍(lán)紫色,均為革蘭氏染色陽性菌。實(shí)驗(yàn)菌的菌體形態(tài)可分為兩類:球狀和短桿狀;球狀菌均為單個(gè)或成鏈狀,短桿菌成單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)。根據(jù)菌落和菌體形態(tài)對(duì)比,可以發(fā)現(xiàn)球狀乳酸菌的菌落要比短桿狀乳酸菌的菌落小,表2列出了分離到的凝乳狀態(tài)和感官評(píng)價(jià)結(jié)果較好的11株菌的形態(tài)特征。

2.2 生理生化及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將分離到的56株乳酸菌進(jìn)行生理生化及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),表3是其中11株菌的生理生化鑒定結(jié)果,表4是糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 乳酸菌的形態(tài)特征Table 2 Characteristics of Lactic acid bacteria

注:“+”表示革蘭氏陽性

表3 生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Result of identification physico-chemical properties

注:“+”表示陽性“-”表示陰性。

表4 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of sugar fermentation

注:“+”表示陽性“-”表示陰性。

由表3可見,產(chǎn)氣的菌株為Alt-1-a、Alt-1-b、Alt-2(2)、KS-4-b和KS-5-b(2),屬于異型發(fā)酵,其余為同型發(fā)酵。根據(jù)生理生化反應(yīng)和形態(tài)學(xué)特征,初步判定所篩選出的球菌HT-b、HT-e、HT-f為鏈球菌屬,桿菌為乳桿菌屬。

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results

2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)分離菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),通過凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察,圖1是其中11株菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。從圖1可知,除了Alt-2(2)和Alt-1-a兩珠菌外,均有擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹及菌相分析

通過BLAST比對(duì),選取GenBank中16株與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的參比菌株做系統(tǒng)發(fā)育樹分析(表5)。

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA seaqences

對(duì)菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中參比菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比較鑒定,用MEGA 5軟件以NJ法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。BLAST序列比對(duì)表明基因序列全部歸屬于乳酸菌。系統(tǒng)發(fā)育分析歸為乳酸桿菌科和腸球菌科。所有分離的56株乳酸菌的16S rDNA序列通過BLAST比對(duì)鑒定,其菌相構(gòu)

表5 用于多序列比較的參比菌株Table 5 List of the strains used

成為德氏式乳桿菌Lactobacillusdelbrueckiisubsp.46株,占所篩選菌種數(shù)的82%;發(fā)酵乳桿菌Lactobacillusfermentum2株,占所篩菌種數(shù)的4%;瑞士乳桿菌Lactobacillushelveticus2株,占所篩菌種數(shù)的4%;嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilusstrain1株,占所篩菌種數(shù)的2%;雞乳桿菌Lactobacillusgallinarumstrain 2株,占所篩菌種數(shù)的4%;屎腸球菌Enterococcusfaecium1株,占所篩菌種數(shù)的2%;耐久腸球菌Enterococcusduransstrain 2株,占所篩菌種數(shù)的4%。說明新疆傳統(tǒng)酸奶中菌相構(gòu)成以德氏乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。

3 結(jié)論

新疆喀什、和田等地是中國的長壽之鄉(xiāng),酸奶是當(dāng)?shù)鼐用袷秤昧孔疃嗟囊环N乳制品。乳酸菌是世界公認(rèn)的益生菌,新疆傳統(tǒng)酸奶中存在著大量的乳酸菌菌群,其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值非常高,因而,篩選鑒定新疆傳統(tǒng)酸奶中的乳酸菌并分析其菌相構(gòu)成具有重要的實(shí)際意義。本研究從新疆采集的22個(gè)酸奶樣品中共分離出56株乳酸菌,通過形態(tài)特征觀察、生理生化、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)鑒定手段,結(jié)合16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明新疆傳統(tǒng)酸奶中德氏乳桿菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(82%),其他菌株所占比例較小,如發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雞乳桿菌、屎腸球菌、耐久腸球菌等各占2%～4%。

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Screening,identification and microflora analysis of Lactic acid bacteria from Xinjiang traditional yogurts

YANG Jie,ZHANG Wen-liang,ZOU Jian-jun,HU Min,YUAN Xue-lin,LIU Yun-guo*

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

Yogurt is one of the poplular dairy foods for minority nationalities in Xinjiang. Fifty-six Lactic acid bacteria were isolated from 22 yogurt samples collected from Xinjiang. They were identified by observation of morphological characteristics,physiological and biochemical tests,sugar fermentation tests,and sequence analysis of 16S rDNA. The microflora in Xinjiang traditional yogurts include 46 strains ofL.delbrueckiisubsp,accounted for 82%,2 strains ofL.fermentum,accounted for 4%,1 strains ofEnterococcusfaecalis,accounted for 2%,and 2 strains ofEnterococcuscanis,accounted for 4%. It indicateed thatL.delbrueckiisubspwas the dominant bacteria in Xinjiang traditional yogurts.

Xinjiang traditional yogurt;Lactic acid bacteria;microflora;16S rDNA

2014-02-20

楊潔(1963-)，女，博士，副教授，研究方向：生物化學(xué)和天然產(chǎn)物研究。

*通訊作者:劉云國(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS252

A

1002-0306(2015)01-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.060